PODŁOŻE LÖWENSTEIN-JENSEN: PODKŁAD, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIE - BIOLOGIA - 2026

Löwenstein-Jensen medium jest selektywnym podłożem stałym, w celu wyodrębnienia i rozwoju bakterii z rodzaju Mycobacterium, takie jak Mycobacterium tuberculosis, M. avium, między innymi, za wyjątkiem gatunków leprae, która nie nadaje się do hodowli.

Bakterie z rodzaju Mycobacterium nie rosną w konwencjonalnych pożywkach hodowlanych, dlatego konieczne było zaprojektowanie specjalnego podłoża do ich izolacji. Oryginalne medium zostało stworzone przez Löwensteina, a później zmodyfikowane przez Jensena.

Podłoże Löwenstein-Jensen z koloniami Mycobacterium tuberculosis. Źródło: Agarwal et al / BioMed Central Ltd., dzięki uprzejmości Biology Image Library

Modyfikacja polegała na wyeliminowaniu czerwonego barwnika Kongo, zastępując go wyższym stężeniem zieleni malachitowej. Zmienił również stężenia cytrynianu magnezu i fosforanu monopotasu.

Podłoże Löwenstein-Jensen zawiera obecnie skrobię ziemniaczaną, asparaginę, cytrynian magnezu, fosforan monopotasu, siarczan magnezu, zieleń malachitową, kwas nalidyksowy, cykloheksymid, linkomycynę, roztrzepane jajka, glicerynę i wodę.

Mykobakterie są zwykle izolowane z miejsc, które nie są sterylne, takich jak między innymi plwocina, mocz, ropnie. Oznacza to, że większość próbek będzie zawierać zwykłą mikrobiotę danego obszaru oraz patogen.

Dlatego pożywka Löwenstein-Jensen zawiera w swoim składzie szereg inhibitorów reprezentowanych przez zieleń malachitową, antybiotyki i leki przeciwgrzybicze.

Ponadto próbki pochodzące z miejsc niesterylnych muszą zostać odkażone i zneutralizowane przed wysianiem na pożywce Löwenstein-Jensen.

Podstawa

Obecność jaja i gliceryny w podłożu Löwenstein-Jensen stymuluje wzrost prątków, ponieważ dostarczają kwasów tłuszczowych i białek niezbędnych do rozwoju tych mikroorganizmów.

Pożywka Löwenstein-Jensen zawiera zieleń malachitową, która jest inhibitorem towarzyszącej mikrobioty. Ale zawiera również kwas nalidyksowy (35 µg / ml), który hamuje mikroflorę Gram-ujemną, cykloheksymid (400 µg / ml), który hamuje rozwój grzybów saprofitycznych i drożdżaków oraz linkomycynę (2 µ / ml), która hamuje mikroflorę Gram-dodatnią.

Niektóre domy handlowe wolą dodawać następującą kombinację antybiotyków: polimyksyna B 200 000 jednostek / l, amfoterycyna B 10 mg / l, karbenicylina 50 mg / l i trimetoprim 10 mg / l.

To podłoże nie zawiera agaru, dlatego krzepnięcie podłoża następuje w wyniku koagulacji albuminy obecnej w jaju podczas sterylizacji.

Przygotowanie

Odważyć 37,3 g odwodnionej pożywki w 600 ml wody destylowanej, do której wcześniej dodano 12 ml glicerolu. Mieszaninę ogrzewa się, często mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia. Autoklawuj pożywkę w 121 ° C przez 15 minut.

Natomiast jednorodną zawiesinę 1000 ml świeżych jaj należy przygotować w warunkach aseptycznych. Zawiesinę jajeczną dodać do 600 ml pożywki przygotowanej w temperaturze 50 - 60 ° C, unikając pęcherzyków powietrza.

Roztwory antybiotyków są również dodawane po sterylizacji w autoklawie.

Wlej pożywkę do sterylnych probówek z zakrętkami. Ogrzewać probówki w temperaturze 85 ° C przez 45 minut w pozycji pochylonej.

Kolor przygotowanej pożywki jest seledynowo zielony i może wykazywać białawe plamy ze względu na obecność lipidów jaja.

PH pożywki musi wynosić 7,2 ± 0,2

Do czasu użycia przechowywać probówki w lodówce i chronić przed bezpośrednim światłem. Odpuszczać przed siewem.

Istnieje modyfikacja medium o nazwie "Gruft modyfikacja Löwenstein Jensen". Zawiera te same związki, co klasyczne podłoże, ale dodaje się RNA-5 mg / 100 ml, a jako inhibitory zawiera zieleń malachitową 0,025 g / 100 ml, penicylinę 50 U / ml i kwas nalidyksowy 35 ug / ml.

Aplikacje

Pożywka Löwenstein-Jensen służy do izolacji prątków z różnych typów próbek. Barwienie Ziehl-Neelsen jest zalecane w przypadku każdej próbki, w której podejrzewa się obecność prątków.

Niektóre próbki pochodzą z miejsc sterylnych, a inne nie. Próbki niesterylne należy odpowiednio odkazić:

Plwocina

Próbki plwociny należy odkazić w następujący sposób: określić ilość plwociny w ml i dodać taką samą ilość 4% NaOH do próbki i inkubować w 37 ° C.

Często wstrząsaj miksturą w ciągu 30 minut. Następnie wirować przy 3000 RPM przez 30 minut.

Wyrzucić supernatant na fenolowy roztwór dezynfekujący. Użyć osadu do siewu, ale najpierw należy zneutralizować pH.

Aby zneutralizować osad, stosuje się 5% H ₂ SO ₄ w obecności wskaźnika czerwieni fenolowej, aż do uzyskania neutralnego pH, które daje kolor łososiowy.

Płukanie żołądka, płukanie oskrzeli i aspirat oskrzelowy

W takim przypadku próbkę należy odwirować przy 3000 obr./min przez 30 minut. Supernatant odrzuca się i stosuje się osad. Aby odkazić osad, dodać 3 ml 4% NaOH i często mieszać w temperaturze 37 ° C przez pół godziny.

Ponownie odwirować, supernatant jest odrzucany i używany jest osad. Ten ostatni należy zneutralizować, jak wyjaśniono w próbce plwociny.

Mocz

Pozostaw próbkę do osadzenia w lodówce na 24 godziny. Oddziel supernatant. Pozostały osad należy wirować przez 30 minut z prędkością 3000 RMP. Ponownie wyrzucić supernatant i odtworzyć osad 3 ml sterylnego roztworu fizjologicznego.

Dodać 3 ml 4% NaOH i przystąpić do odkażania i neutralizacji zgodnie z wcześniejszym opisem.

Płyn z wodobrzusza, płyn opłucnowy, płyn mózgowo-rdzeniowy

W przypadku tego typu próbki odwirowuje się, a supernatant odrzuca. Wykonaj Grama na osadzie lub obserwuj bezpośrednio pod mikroskopem; Jeśli bakterie nie są obserwowane, etap odkażania nie jest konieczny, podobnie jak etap neutralizacji.

W takim przypadku próbkę można wysiewać bezpośrednio z osadu. Jeśli są bakterie, przystąp do odkażania i neutralizacji, jak opisano powyżej.

Biopsje

Do tego typu próbki należy dodać 5 ml wody destylowanej w celu późniejszego odwirowania przy 1500 obr./min przez 10 minut. Odrzucić supernatant i ponownie odwirować osad przy 3500 RPM przez 30 minut. Użyj osadu do wysiania pożywki hodowlanej.

Wymaz z krtani

Wymazówkę należy umieścić w sterylnej probówce zawierającej równe części wody destylowanej i 4% NaOH. Wymazówkę należy przycisnąć do ścianek probówki, aby próbka została rozcieńczona w płynie. Odwirować i użyć osadu. Zneutralizuj osad, jak już opisano.

Posiany

Pożywkę Löwenstein-Jensen zaszczepia się, dodając 0,5 ml próbki na powierzchnię pożywki. Obróć probówkę, aby rozprowadzić próbkę w podłożu. Nie używaj platynowego uchwytu.

Drugą probówkę zawierającą pożywkę Stonebrink można wysiać w celu izolacji Mycobacterium bovis i innych gatunków, które nie rosną na pożywce Löwenstein-Jensen.

Inkubacja

Zaszczepione probówki inkubuje się w warunkach tlenowych w 37 ° C, z lekko luźną zakrętką, nachyloną pod kątem około 5 ° i chronioną przed światłem. Środowisko można wzbogacić 5–10% dwutlenkiem węgla. Sprawdzaj kultury dwa razy w tygodniu, aż pojawią się kolonie.

Po wchłonięciu próbki zatyczki są dokręcane. Maksymalny czas inkubacji wynosi 8 tygodni, jeśli po tym czasie nie ma wzrostu, jest on zgłaszany jako ujemny.

QA

Do kontroli jakości można użyć następujących szczepów:

Mycobacterium tuberculosis ATCC 27294, Mycobacterium kansasii ATCC 12478, Mycobacterium avium ATCC 19291, Mycobacterium bovis ATCC 19219, Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, Escherichia coli ATCC 25922, Streptococcus pyogenes ATCC of 32015 z Cryptoccus z 32015, Cryptocematcus z 19615, Cryptocematcus,

Oczekuje się doskonałego rozwoju dla trzech pierwszych wymienionych gatunków, ponieważ M. fortuitum powinien rosnąć dobrze, natomiast dla M. bovis oczekuje się niewielkiego wzrostu lub żadnego wzrostu. Tymczasem gatunki inne niż rodzaj Mycobacterium muszą zostać całkowicie zahamowane.

Ograniczenia

Przygotowane podłoże należy chronić przed światłem, długotrwałe działanie światła powoduje zmianę jego koloru z zielonego na niebieski, w takim przypadku nie można go już używać. Dzieje się tak, ponieważ zieleń malachitowa jest światłoczuła.

Pożywka, ponieważ zawiera jajka, może być łatwo zanieczyszczona, jeśli nie jest traktowana aseptycznie. Można go rozpuścić, jeśli zostanie zanieczyszczony bakteriami proteolitycznymi.

Hodowla i obchodzenie się z bakteriami z rodzaju Mycobacterium wymaga wykwalifikowanego personelu, który jest świadomy środków bezpieczeństwa biologicznego, których należy przestrzegać, aby uniknąć zakażenia lub zakażenia innych.

HCl nie powinien być używany na etapie neutralizacji ze względu na tworzenie się chlorku sodu, który może być toksyczny dla Bacillus Kocha.

Próbki należy przechowywać w lodówce i chronić przed światłem, gdy nie są przetwarzane.

Odniesienie

1. Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. Pożywka selektywna Löwenstein-Jensen. Dostępne pod adresem: f-soria.es
2. Britannia Laboratories. 2017. Pożywka Löwenstein-Jensen. Dostępne na: britanialab.com.
3. Neogen Laboratories. Pożywka Löwenstein-Jensen. Dostępne pod adresem: foodsafety.neogen.com.
4. „Medium Löwenstein-Jensen”. Wikipedia, wolna encyklopedia. 20 listopada 2018, 15:15 UTC. 24 kwietnia 2019, 18:34. wikipedia.org
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
7. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne do identyfikacji bakterii o znaczeniu klinicznym. 3rd ed. Od redakcji Panamericana. Buenos Aires. Argentyna.