REKOMBINOWANE DNA: TECHNIKA, ZASTOSOWANIA I PODSTAWY - BIOLOGIA - 2025

Rekombinowanego DNA (rDNA lub rekombinowana) sztuczny cząsteczka kwasu nukleinowego, utworzony w laboratorium, przez połączenie dwóch segmentów zainteresowanych organizacji. Jest również znany jako chimeryczny DNA, dzięki swojej hybrydowej właściwości. Ten typ DNA nie występuje w naturze.

Podstawowa metodologia jej generowania obejmuje: (a) wybór docelowego DNA i jego wstawienie do innego fragmentu DNA (zazwyczaj plazmidu bakteryjnego); (b) wprowadzenie tego plazmidu do bakterii, (c) selekcja bakterii za pomocą antybiotyków i wreszcie (d) ekspresja genu.

Źródło: pixabay.com

Technika wykorzystuje zestaw enzymów, które umożliwiają kopiowanie i wklejanie określonych fragmentów DNA zgodnie z oceną badacza.

Celem technologii rekombinacji jest w większości przypadków ekspresja białka (znanego jako białko rekombinowane) pożądanego przez biologa molekularnego do przyszłych badań lub stworzenie białka o wartości handlowej i terapeutycznej - takiego jak insulina ludzka, na przykład.

Podstawy techniki rekombinacji DNA i jej zastosowanie w inżynierii genetycznej

Centralny dogmat biologii molekularnej

Wszystkie znane nam istoty organiczne mają kilka cech wspólnych. Jedną z nich jest natura materiału genetycznego i sposób wytwarzania białek - proces znany jako centralny „dogmat” biologii molekularnej.

Z wyjątkiem kilku wirusów, wszystkie organizmy przechowują informację genetyczną w DNA (kwasie dezoksyrybonukleinowym), zebranym w bardzo zwarty i zorganizowany sposób w jądrze komórki.

W celu ekspresji genów cząsteczka DNA jest przepisywana na informacyjny RNA, a ten ostatni jest tłumaczony na język aminokwasów, elementów budulcowych białek.

Co to jest rekombinowane DNA?

Między 1970 a 1980 rokiem biologowie molekularni zaczęli wykorzystywać procesy, które naturalnie zachodzą w komórce i byli w stanie ekstrapolować je do laboratorium.

W ten sposób gen pochodzenia zwierzęcego (na przykład kręgowca) mógłby zostać wstawiony do segmentu DNA z bakterii; lub DNA bakterii można połączyć z wirusowym DNA. Zatem możemy zdefiniować rekombinowany DNA jako cząsteczkę złożoną z DNA z dwóch różnych organizmów.

Po utworzeniu tej hybrydowej lub rekombinowanej cząsteczki następuje ekspresja interesującego genu. Poprzez wyrażenie słowo chcemy odnieść się do procesu translacji na białko.

Enzymy restrykcyjne i ligazy: klucz do procesu

Kluczowym elementem w rozwoju technologii rekombinacji DNA było odkrycie enzymów restrykcyjnych.

Są to cząsteczki białek, które wykazują zdolność rozszczepiania DNA (nukleaz) na określone sekwencje, pełniąc rolę „molekularnych nożyczek”. Fragmenty generowane przez te enzymy nazywane są fragmentami restrykcyjnymi.

Wspomniane enzymy mogą wytwarzać symetryczne cięcia w sekwencji docelowej (w obu łańcuchach na tej samej wysokości) lub asymetryczne cięcia. Kluczowym aspektem działania enzymów restrykcyjnych jest to, że po przecięciu łańcuchów uzyskuje się „luźną krawędź”, komplementarną do drugiej krawędzi przeciętej przez ten sam enzym.

Niektóre przykłady to ECOR 1 i Sma 1. Obecnie ponad 200 typów enzymów restrykcyjnych jest znanych i dostępnych w handlu.

Aby były przydatne, do nożyczek musi towarzyszyć klej. To działanie uszczelniające DNA (wcześniej traktowanego enzymami restrykcyjnymi) jest przeprowadzane przez ligazy.

Technika: w jaki sposób DNA organizmu jest sztucznie modyfikowane w laboratorium?

Poniżej opiszemy główne kroki, których wymaga technologia rekombinacji DNA. Wszystkie są wykonywane przez profesjonalistów w laboratorium biologii molekularnej.

Co to jest „klon”?

Zanim przejdziemy dalej do protokołu eksperymentalnego, musimy zauważyć, że w biologii molekularnej i biotechnologii powszechnie używa się terminu „klon” i czasownika „klon”. Może to prowadzić do zamieszania.

W tym kontekście nie mówimy o klonowaniu całego organizmu (jak na przykład w przypadku słynnej owcy Dolly), ale o klonowaniu fragmentu DNA, który może być genem. Oznacza to, że wytwarza wiele kopii - genetycznie identycznych - sekwencji.

1. Izolacja i otrzymywanie DNA

Pierwszym krokiem jest podjęcie decyzji, której sekwencji chcesz użyć. Zależy to całkowicie od badacza i celów jego pracy. To DNA musi następnie zostać wyizolowane i oczyszczone. Metody i procedury umożliwiające osiągnięcie tego zależą z kolei od organizmu i tkanki.

Na ogół pobiera się fragment tkanki i poddaje obróbce w buforze do lizy z proteinazą K (enzymem proteolitycznym), a następnie ekstrahuje się DNA. Następnie materiał genetyczny jest fragmentowany na małe fragmenty.

2. Wektor do klonowania

Po wykonaniu czynności przygotowawczych, badacz stara się wprowadzić interesujący segment DNA do wektora do klonowania. Odtąd będziemy nazywać ten segment DNA białym DNA.

Plazmidy

Jeden z najczęściej używanych wektorów w plazmidzie pochodzenia bakteryjnego. Plazmid to dwuniciowa, kolista cząsteczka DNA, która występuje naturalnie w bakteriach. Są obce chromosomowi bakteryjnemu - to znaczy są pozachromosomalne i występują naturalnie w tych prokariotach.

Podstawowymi elementami wektora są: (a) miejsce inicjacji replikacji, które umożliwia syntezę DNA; (b) czynnik selekcyjny, który umożliwia identyfikację organizmów niosących plazmid z docelowym DNA, np. oporność na niektóre antybiotyki; oraz (c) miejsce multiklonowania, w którym znajdują się sekwencje, które będą rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne.

Pierwszy udany zrekombinowany DNA w laboratorium został sklonowany do plazmidu pSC101 z bakterii E. coli. Zawiera on miejsce restrykcyjne dla enzymu restrykcyjnego EcoRI i gen oporności na antybiotyk, oprócz miejsca inicjacji replikacji.

Wstawienie docelowego DNA do plazmidu przeprowadza się za pomocą narzędzi molekularnych enzymów restrykcyjnych i ligaz opisanych w poprzedniej sekcji.

Pozostałe typy wektorów

Oprócz plazmidów DNA można wstawić do innych wektorów, takich jak bakteriofag lambda, kosmidy, YAC (sztuczne chromosomy drożdży), BAC (sztuczne chromosomy bakteryjne) i fagemidy.

3. Wprowadzenie rekombinowanego DNA

Po uzyskaniu rekombinowanej cząsteczki DNA (genu będącego przedmiotem zainteresowania w plazmidzie lub innym wektorze) jest ona wprowadzana do gospodarza lub organizmu gospodarza, którym może być bakteria.

Aby wprowadzić obcy DNA do bakterii, stosuje się technikę zwaną transformacją bakteryjną, w której organizm poddaje się działaniu dwuwartościowych kationów, co czyni go podatnym na pobieranie DNA.

Metodologicznie nie możemy zagwarantować, że 100% bakterii w naszej hodowli skutecznie pobrało naszą rekombinowaną cząsteczkę DNA. Tutaj do gry wchodzi część plazmidu, która zawiera oporność na antybiotyki.

Zatem bakterie, które pobrały plazmid, będą oporne na określony antybiotyk. Aby je wybrać, wystarczy zastosować wspomniany antybiotyk i zabrać ocalałych.

4. „Zbierz” białko

Po wybraniu bakterii za pomocą naszego rekombinowanego DNA, przystępujemy do wykorzystania maszynerii enzymatycznej gospodarza do wytworzenia interesującego nas produktu białkowego. W miarę rozmnażania się bakterii plazmid jest przekazywany ich potomstwu, więc nie jest tracony podczas podziału.

Ta procedura wykorzystuje bakterie jako rodzaj „fabryki” białka. Później zobaczymy, że była to bardzo istotna procedura w opracowywaniu skutecznych metod leczenia.

Gdy hodowla jest już gotowa, a bakterie wyprodukują duże ilości białka, komórka jest poddawana lizie lub niszczona. Istnieje wiele technik biochemicznych, które pozwalają na oczyszczanie białek zgodnie z ich właściwościami fizykochemicznymi.

W innym kontekście eksperymentalnym możemy nie być zainteresowani generowaniem białka, ale raczej jesteśmy zainteresowani uzyskaniem sekwencji DNA jako takiej. Gdyby tak było, plazmid zostałby użyty do stworzenia wielu kopii interesującego nas fragmentu, aby mieć wystarczającą ilość docelowego DNA do przeprowadzenia odpowiednich eksperymentów.

Aplikacje

Technologia rekombinacji DNA otworzyła nieskończoną liczbę możliwości w biologii molekularnej, biotechnologii, medycynie i innych pokrewnych dziedzinach. Oto jego najwybitniejsze zastosowania.

Analiza genetyczna

Pierwsza aplikacja jest bezpośrednio związana z laboratoriami biologii molekularnej. Technologia rekombinacji DNA umożliwia naukowcom zrozumienie normalnej funkcji genów, a wygenerowane białka można wykorzystać w dalszych badaniach.

Przemysł farmaceutyczny

Białka wyprodukowane metodą rekombinacji DNA mają zastosowanie w medycynie. Dwa bardzo istotne przykłady w tej dziedzinie to insulina ludzka i hormon wzrostu, które są stosowane u pacjentów, u których tego białka brakuje.

Dzięki rekombinowanemu DNA białka te mogą być generowane bez konieczności ekstrakcji od innego człowieka, co wiąże się z dodatkowymi komplikacjami metodologicznymi i zagrożeniami dla zdrowia. Pomogło to poprawić jakość życia niezliczonych pacjentów.

Bibliografia

1. Baca, LEL i Álvarez, CLC (2015). Biologia 2. Grupo Editorial Patria.
2. Cooper, GM, Hausman, RE i Hausman, RE (2000). Komórka: podejście molekularne (tom 10). Waszyngton, DC: ASM press.
3. Devlin, TM (2004). Biochemia: podręcznik o zastosowaniach klinicznych. Odwróciłem się.
4. Khan, S., Ullah, MW, Siddique, R., Nabi, G., Manan, S., Yousaf, M. i Hou, H. (2016). Rola technologii rekombinacji DNA w poprawie życia. Międzynarodowy dziennik genomiki, 2016, 2405954.
5. Mindán, FP i Mindan, P. (1996). Anatomia patologiczna. Elsevier Hiszpania.
6. Tortora, GJ, Funke, BR i Case, CL (2007). Wprowadzenie do mikrobiologii. Panamerican Medical Ed.
7. The, MJ (1989). Insulina ludzka: pierwszy lek w technologii DNA. American Journal of Health-System Pharmacy, 46 (11_suppl), S9-S11.