BIURET: UZASADNIENIE, ODCZYNNIKI, PROCEDURA, ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Biuretu jest odczynnikiem do oznaczania białka o długim łańcuchu i krótkim łańcuchu. Jest szczególnie stosowany w chemii analitycznej i analizie moczu do badania stężenia białek całkowitych w surowicy, osoczu i moczu.

W niektórych stanach chorobowych wartości białka mogą się zwiększyć lub zmniejszyć. Objawy hipoproteinemii występują zwykle u pacjentów z chorobami nerek, u pacjentów niedożywionych oraz u pacjentów z przewlekłymi zakażeniami.

Struktura chemiczna kompleksu powstałego w reakcji Biureta Positive Biuret test. Źródło: Yikrazuul / flickr

Podczas gdy hiperproteinemię obserwuje się w patologiach, takich jak między innymi szpiczak mnogi, toczeń rumieniowaty układowy, bakteryjne zapalenie wsierdzia, bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych, makroglobulinemia Waldenstroma.

Z drugiej strony obecność białka w moczu jest spowodowana filtracją albuminy przez nerki. To jest patologiczne zachowanie, które należy zbadać.

W tym sensie Biuret jest bardzo przydatny, ponieważ pozwala na ilościowe określenie obecności białek w surowicy, osoczu, moczu i wielu innych próbkach.

Nawet Biuret może być użyty do badania obecności i stężenia białek w słabo zbadanych próbkach lub próbkach o nieznanym składzie. Dlatego jest szeroko stosowany w obszarze badań.

Test Biuret polega na wykrywaniu wiązań peptydowych. Test odbywa się w środowisku zasadowym. Próbka musi zawierać co najmniej dwa wiązania peptydowe, aby powstał kompleks fioletowo-fioletowy. Kompleks powstaje w wyniku połączenia wiązań i jonu miedzi.

Podstawa

Odczynnik Biureta składa się z wodorotlenku potasu, siarczanu miedzi oraz winianu sodu i potasu. Do alkalizacji środowiska stosuje się wodorotlenek sodu, ponieważ warunek ten jest niezbędny do zajścia reakcji.

Substancją, która reaguje z białkami jest siarczan miedziowy, podczas gdy winian sodu ma za zadanie nie dopuścić do powstania wodorotlenku miedzi, który ma tendencję do wytrącania się i zakłóca przebieg reakcji.

Jeśli w próbce zostaną znalezione substancje z wiązaniami peptydowymi (polipeptydy lub białka), wynik testu będzie pozytywny.

Reakcja jest interpretowana jako pozytywna, gdy roztwór zmienia kolor na fioletowy. Kolor powstaje w wyniku utworzenia kompleksu między co najmniej dwoma wiązaniami peptydowymi zawierającymi grupę CO-NH i kationami miedziowymi.

Fioletowy kompleks można utworzyć na dwa sposoby: jeden to utrata protonów z grup amidowych, które wiążą się z metalem (depronotacja), a drugi to połączenie wolnych i wiążących elektronów tlenu i azotu z miedzią.

Ta reakcja może różnić się intensywnością i kolorem w zależności od rodzaju białka.

Test można przeprowadzić jakościowo lub ilościowo. W formie jakościowej jest zgłaszany jako pozytywny lub negatywny. W postaci ilościowej stężenie można zmierzyć metodą spektrofotometryczną.

Reakcję odczytuje się między 540-560 nm. Intensywność koloru jest wprost proporcjonalna do stężenia wiązań peptydowych w próbce.

Odczynniki

-20% wodorotlenku sodu (NaOH)

-Pentahydrat siarczanu miedzi 1% (CuSO _4, 5H ₂ O)

-Mieszany tetrahydrat winianu sodu i potasu (KNaC ₄ H ₄ O ₆ · 4H ₂ O)

Stabilność odczynników biuretowych

-Musi być przechowywany w lodówce.

Proces

Technika

-Umieść 100 µl próbki lub wzorca do analizy w probówce.

-Dodaj 2 ml wodorotlenku sodu.

-Mieszać bardzo dobrze.

-Dodaj 5 ml odczynnika Biuret.

-Wymieszać i odstawić na 25 minut w temperaturze pokojowej, przykryć i chronić przed światłem.

-Obserwuj tworzenie się koloru lub nie i dokonuj pomiarów spektrofotometrycznie.

Krzywa kalibracyjna

Albumina surowicy bydlęcej może być stosowana jako wzorzec do wykonania krzywej kalibracji. Przygotowuje się z niego różne stężenia. Na przykład 25, 50, 75, 100, 125 i 150%.

Reakcję przeprowadza się przy wszystkich tych znanych stężeniach i odczytuje się absorbancję przy długości fali 540 nm. Z danych znanych stężeń i odczytów absorbancji sporządza się krzywą kalibracyjną.

W każdym oznaczeniu lub partii przetwarzanych próbek zaleca się zamontowanie wzorca. Albumina surowicy bydlęcej 0,1-2 mg / ml może być stosowana jako wzorzec kalibracyjny.

Pomiary wykonuje się na spektrofotometrze przy 540 nm.

Liniowość jest zachowana do stężenia 12 g / dl.

Ingerencja

Substancje zakłócające test Biureta

Chociaż nie jest to bardzo częste, należy zauważyć, że niektóre substancje mogą przeszkadzać podczas wykonywania tego testu. Na przykład obecność amoniaku może hamować powstawanie koloru.

Podobnie inne substancje mogą absorbować na tej samej długości fali, na przykład niektóre pigmenty.

Z drugiej strony interferencja może powstać, gdy substancja inna niż wiązanie peptydowe tworzy kompleks z solą miedziową. Przykład: niektóre węglowodany i określone lipidy.

W przypadku, gdy próbka do analizy zawiera pewien rodzaj osadu, należy go przefiltrować lub odwirować przed zamontowaniem testu.

Substancje, które nie zakłócają testu Biureta

Na test nie ma wpływu obecność:

-Bilirubina do stężenia 20 mg / dl.

-Hemoglobina do stężenia 750 mg / dl.

-Dekstran do stężenia 30 g / l.

-Triglicerydy do stężenia 4000 mg / dl.

Korzyść

-Jest to prosta metoda wykonania.

-To test ekonomiczny.

-Ma wysoką specyficzność wobec białek.

-Mała ingerencja.

Niedogodności

Ma słabą czułość w wykrywaniu małych ilości białka. Praca wykonana przez Fuentes i wsp. Potwierdza, że ​​metoda testu Biuret ma granicę wykrywalności 1 mg / ml białka i granicę oznaczalności 3 mg / ml.

Jednak inne badania przeprowadzone na University of Amazonia podają znacznie niższe wartości. Podana w badaniu granica wykrywalności wynosi 0,020 mg / ml, a granica oznaczalności wynosi 1,33 mg / ml.

Aplikacje

Odczynnik lub test Biuret służy do oznaczania białek w próbkach klinicznych i nieklinicznych w laboratoriach rutynowych i badawczych.

Patologie, które występują wraz ze wzrostem lub spadkiem

W wielu patologiach ważne jest określenie całkowitego stężenia białek w próbkach klinicznych, które może być podwyższone lub obniżone.

Są wyniesieni w:

-Szpiczak mnogi,

- toczeń rumieniowaty układowy,

-Bakteryjne zapalenie wsierdzia,

-Bakteryjne zapalenie opon mózgowych,

Makroglobulinemia Waldenstroma, między innymi.

Zmniejsza się w:

-Niewydolność nerek,

-Osoby ze znacznym stopniem niedożywienia,

-Pacjenci z przewlekłymi infekcjami m.in.

Próbki kliniczne

Najczęstsze próbki kliniczne to surowica, osocze i mocz. Prawidłowa wartość białek w surowicy lub osoczu wynosi 6,0-8,8 gr / dl.

Stężenie białek w moczu u dorosłych nie przekracza 150 mg / dobę.

Normalna wartość stosunku białka w moczu do kreatyniny w moczu

Niemowlęta: <0,50 mg

Dzieci w wieku 2 lat i starsze: indeks: 0,20 mg

Dorośli: <0,2 mg

Próbki niekliniczne

Reakcja Biureta może być stosowana do wielu rodzajów próbek nieklinicznych, takich jak produkty mleczne, antytoksyna lub dowolna nieznana substancja, w przypadku której chcesz zbadać obecność białek.

Bibliografia

1. Vázquez J, Guerra L, Quintana J, Ramírez J, Fernando Ry Vázquez Y. (2014). Charakterystyka fizykochemiczna i zawartość białka w płynnych ekstraktach ostrygi mangrowej (Crassostrearizophorae). Cuban Journal of Chemistry, 26 (1), 66–74. Pobrane 26 czerwca 2019 r. Z http: //scielo.sld
2. Chaparro S, Lara A, Sandoval A, Sosa S, Martínez J, Gil J. Functional characterisation of the almond of mango seeds (Mangifera indica L.) Revista Ciencia en Desarrollo. 2015; 6 (1): 67–75
3. „Biuret”. Wikipedia, wolna encyklopedia. 19 czerwca 2019, 16:37 UTC. 26 czerwca 2019, 22:18
4. Fuentes F, Quispe I, García J. Standaryzacja metody Biuret do ilościowego określania ilości białek w wielowartościowej surowicy antyotropowej produkowanej w INS National Center for Biological Products. Bol - Inst Nac Salud 2012; 18 (11-12). Dostępne pod adresem: repositorio.ins.gob.pe
5. Winer Laboratories. Całkowite białka. Metoda kolorymetryczna oznaczania całkowitych białek w surowicy i osoczu. Dostępne pod adresem: wiener-lab.com.ar