BUFOR FOSFORANOWY (PBS): UZASADNIENIE, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Bufor fosforanowy lub sól fizjologiczna buforowana fosforanem BPS jest bufor izotoniczny, którego funkcją jest do utrzymania pH i ciśnienie osmotyczne, jak blisko z naturalnym środowisku biologicznym (fizjologicznym). Akronim PBS oznacza sól fizjologiczną buforowaną fosforanem.

PH i osmolarność to dwa bardzo ważne aspekty, które należy kontrolować w niektórych protokołach laboratoryjnych. W przypadku pH istotne jest, aby było ono kontrolowane, zwłaszcza w reakcjach biochemicznych, ponieważ mogą się one różnić lub nie można ich przeprowadzić, jeśli reagenty mają nieodpowiednie pH.

Sól fizjologiczna buforowana fosforanem PBS przy dwóch różnych pH. Źródło: Pixinio.com

Tymczasem kontrola osmolarności jest niezbędna, zwłaszcza podczas pracy z żywymi komórkami, ponieważ błony plazmatyczne komórek reagują zgodnie ze stężeniem substancji rozpuszczonych, w których się znajdują.

Jeśli komórki zostaną przeniesione do pożywki hipertonicznej, zostaną odwodnione, ponieważ gradient wody zostanie przeniesiony na stronę, w której występuje wyższe stężenie substancji rozpuszczonych. Jeśli, wręcz przeciwnie, komórki zostaną umieszczone w pożywce hipotonicznej, komórki będą wchłaniać płyn, dopóki nie zostaną poddane lizie.

Dlatego bufor PBS jest używany w protokołach laboratoryjnych, które wymagają utrzymania komórek in vitro, w ten sposób komórki nie zostaną uszkodzone.

PBS składa się z kombinacji soli, takich jak chlorek sodu, fosforan sodu, chlorek potasu i fosforan potasu. Skład PBS może się różnić w zależności od protokołu.

Podstawa

Zasadniczo funkcją buforu fosforanowego jest utrzymywanie stałego fizjologicznego pH wraz ze stężeniem elektrolitu podobnym do tego występującego w organizmie.

W takim środowisku komórki mogą pozostać stabilne, ponieważ warunki fizjologiczne są symulowane w jak największym stopniu.

W razie potrzeby do oryginalnego preparatu PBS można dodać inne związki, na przykład dodanie EDTA do buforu jest przydatne do przemywania krwinek czerwonych w teście krzyżowej niezgodności.

EDTA zapobiega rozszczepianiu i lizie frakcji dopełniacza C1 obecnego w surowicy do czerwonych krwinek, to znaczy pozwala uniknąć fałszywych wyników niezgodności. Ponadto EDTA pomaga w dysocjacji komórek.

Przygotowanie

Ilość soli, które należy odważyć w celu przygotowania soli fizjologicznej buforowanej fosforanem PBS, będzie zależeć od ilości, którą należy przygotować:

-Roztwór podstawowy soli fizjologicznej buforowany fosforanem (10X PBS)

Na jeden litr roztworu:

Ważyć:

80,6 g NaCl,

2,2 g KCl,

11,5 g Na ₂ HPO ₄ ,

2,0 g KH ₂ HPO ₄

Technika przygotowania

Umieść ciężkie sole w zlewce, dodaj wystarczającą ilość wody (80%) i wymieszaj na płycie mieszającej za pomocą pręta magnetycznego, aż sole się rozpuszczą.

Przygotowanie PBS za pomocą płytki mieszającej z prętem magnetycznym. Źródło: Użytkownik: Ruhrfisch, Wikipedia. com

Filtruj, aby usunąć nierozpuszczone cząsteczki. Używać filtrów o porach 0,45 µm. Autoklawuj i rozprowadź aseptycznie w kapturze z przepływem laminarnym w szklanych słoikach z pokrywkami.

Roztwór 10X (stężony) nie reguluje pH. Korektę przeprowadza się po rozcieńczeniu do stężenia buforu 1X PBS (rozcieńczenie 1:10).

-Buforowa sól fizjologiczna fosforanu (1X PBS)

1X PBS można przygotować bezpośrednio, odważając odpowiednie ilości każdej soli lub można go przygotować przez rozcieńczenie roztworu podstawowego (1:10) sterylną wodą destylowaną.

-Aby przygotować bezpośrednio jeden litr 1X PBS soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, zważ:

8,06 g NaCl,

0,22 g KCl,

1,15 g Na ₂ HPO ₄ ,

0,20 g KH ₂ HPO ₄

Technika przygotowania

Postępuj tak, jak wyjaśniono w stężonym roztworze. Następnie należy dostosować pH. Aby to zrobić, zmierz pH iw zależności od wyniku użyj kwasu (HCl) lub zasady (NaOH), aby odpowiednio obniżyć lub podnieść pH, aż do 7,4.

Kwas lub zasadę dodaje się kropla po kropli, monitorując wartość pH roztworu za pomocą pH-metru. Przefiltrować, autoklawować i aseptycznie rozprowadzić do stożkowych probówek lub słoików, w zależności od potrzeb.

-Aby przygotować 1X PBS z roztworu podstawowego 10X:

Rozcieńczyć 1:10. Na przykład, aby przygotować 1 litr 1X PBS, odmierz 100 ml roztworu podstawowego i dodaj 700 ml sterylnej wody destylowanej. Wyreguluj pH i uzupełnij ilość wody do 1000 ml.

Przygotowany bufor PBS jest bezbarwny i przezroczysty.

Codziennie PBS można przechowywać w temperaturze pokojowej, a resztę w lodówce.

Roztwory do regulacji pH

HCl

Na 100 ml 1 molowego HCL (kwas solny).

Odmierz 91 ml wody destylowanej i umieść ją w 250-ml zlewce.

Odmierz 8,62 ml stężonego HCl i powoli dodaj go do zlewki zawierającej wodę (nigdy nie rób tego odwrotnie). Podczas pracy z silnymi kwasami (substancją silnie żrącą) należy podjąć odpowiednie środki bezpieczeństwa biologicznego.

Mieszać przez 5 minut najlepiej za pomocą płytki do mieszania z prętem magnetycznym wewnątrz szklanki. Przenieść do 100 ml kolby i dopełnić do 100 ml wodą destylowaną H ₂ O.

NaOH

Na 100 ml NaOH (wodorotlenek sodu) 10 mol.

Odmierz 40 ml wody destylowanej i umieść ją w 250 ml zlewce. Odmierz 40 g NaOH i dodaj do wody. Mieszać za pomocą płytki do mieszania z prętem magnetycznym wewnątrz szklanki.

Przenieść do 100 ml kolby miarowej i uzupełnić do kreski wodą destylowaną. Przestrzegaj przepisów bezpieczeństwa biologicznego, ponieważ ta reakcja jest egzotermiczna (uwalnia energię w postaci ciepła).

Jeśli chcesz przygotować inne ilości roztworu soli fosforanowej, możesz skorzystać z poniższej tabeli:

Źródło: „Laboratorium Genomiki Wirusów i Człowieka, Szkoła Medyczna UASLP”

Aplikacje

Jest stosowany przede wszystkim w biologii komórki, immunologii, immunohistochemii, bakteriologii, wirusologii i laboratoriach badawczych.

Idealnie nadaje się do przemywania komórek przez wirówki (krwinki czerwone), przemywania pojedynczych warstw komórek, w spektroskopowych technikach elipsometrii, do ilościowego oznaczania biofilmów bakteryjnych, w utrzymywaniu kultur komórkowych dla wirusów, jako roztwór do przemywania w technice immunofluorescencji pośredniej oraz w technikach charakteryzowania przeciwciał monoklonalnych.

Służy również do transportu komórek lub tkanek, jako rozcieńczalnik do zliczania komórek, przygotowania enzymów komórkowych (trypsyny), jako rozcieńczalnik do metody osuszania biomolekuł oraz do przygotowania innych odczynników.

Z drugiej strony Martin i wsp. W 2006 roku wykazali, że PBS jest przydatny w laboratoriach kryminalistycznych, szczególnie w odzyskiwaniu nasienia z wymazów z pochwy lub w odzyskiwaniu komórek pochwy z rozmazów prącia. W ten sposób można ustalić, czy miał miejsce związek seksualny.

Ograniczenia

-Niektóre bufory PBS zawierają substancję zwaną azydkiem sodu jako konserwant. Związek ten może wytwarzać substancje wybuchowe, jeśli wejdzie w kontakt z ołowiem lub miedzią. Z tego powodu należy zachować szczególną ostrożność podczas usuwania tego odczynnika do kanalizacji. Jeśli zostanie wyrzucony w ten sposób, należy dodać dużo wody, aby go jak najbardziej rozcieńczyć.

- Nie należy dodawać cynku do buforu fosforanowego, ponieważ powoduje to wytrącanie się soli.

-Wangen i współpracownicy w 2018 roku ustalili, że użycie PBS nie nadaje się do przemywania komórek pierwotnych ostrej białaczki szpikowej (AML) ekstrahowanych z krwi obwodowej, ze względu na fakt, że wiele komórek jest traconych w wyniku lizy, przy dużym ubytku materiału białko.

Dlatego ustalili, że pierwotne komórki AML nie powinny być przemywane PBS po przechowywaniu w ciekłym azocie.

Bibliografia

1. Coll J. (1993). Techniki diagnostyczne w wirusologii. Ed Díaz de Santos. 360 str
2. Rodríguez M, Ortiz T. Cell culture. Zmiana medium. Katedra Cytologii Normalnej i Patologicznej oraz Histologii Uniwersytetu w Sewilli. Dostępne na personal.us.es
3. Przygotowanie soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). (2008). Standardowe procedury operacyjne (SOP) Laboratorium Genomiki Człowieka i Wirusów UASLP Szkoła Medyczna. Dostępne pod adresem: genomica.uaslp.mx
4. „Sól fizjologiczna buforu fosforanowego”. Wikipedia, wolna encyklopedia. 3 kwietnia 2019, 19:36 UTC. 13 kwietnia 2019, 02:57 en.wikipedia.org.
5. Pietrasanta L, Von-Bilderling C. Tematy z biofizyki molekularnej. Dostępne pod adresem: users.df.uba.ar
6. Rediar. Podręcznik. PBS + EDTA. Dostępne pod adresem: felsan.com.ar
7. Martin NC, Pirie AA, Ford LV, Callaghan CL, McTurk K, Lucy D, Scrimger DG. Zastosowanie soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do odzyskiwania komórek i plemników z wymazów. Sci Justice. 2006; 46 (3): 179–84. Dostępne w: ncbi.nlm.nih.gov
8. Wangen R, Aasebø E, Trentani A i wsp. Metoda konserwacji i przemywanie solanką buforowaną fosforanem wpływają na proteom ostrej białaczki szpikowej. Int J Mol Sci. 2018; 19 (1): 296. Dostępne w: ncbi.nlm.nih.gov
9. Martínez R, Gragera R. (2008). Teoretyczne i praktyczne podstawy histochemii. Naczelna Rada Badań Naukowych. Madryt. Dostępne pod adresem: books.google.co.ve