BULION MALONIANOWY: PODKŁAD, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Malonian brzeczka jest płynne podłoże hodowlane stosowane do diagnostycznego testu (malonowego), do różnicowania pewne rodzajów z rodziny Enterobacteriaceae. Został stworzony przez Leifsona w 1933 roku i później zmodyfikowany przez Ewinga, który dodał niewielką ilość dekstrozy i ekstraktu drożdżowego do oryginalnej formuły.

Obecnie pożywka składa się z ekstraktu drożdżowego, siarczanu amonu, fosforanu dipotasowego, fosforanu jednopotasowego, chlorku sodu, malonianu sodu, dekstrozy i błękitu bromotymolowego. Test ten jest generalnie częścią zestawu identyfikacji biochemicznej Enterobacteriaceae, pomagając w rozróżnieniu niektórych rodzajów i gatunków.

Graficzne przedstawienie testu malonianu. A. Test negatywny, B. (zakwaszenie) test negatywny, C. (średnia alkalizacja) Test pozytywny. Źródło: kolorowe rurki publicdomainpictures.net

Test malonianu opiera się głównie na zdolności niektórych mikroorganizmów do wykorzystywania malonianu sodu jako jedynego źródła węgla oraz siarczanu amonu jako źródła azotu.

Test malonianu jest zwykle dodatni u niektórych gatunków z rodzaju Enterobacter, Klebsiella i Citrobacter. Natomiast większość gatunków z rodzajów Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus i Providencia daje reakcję negatywną.

Podstawa

Test z malonianem polega na pokazaniu bakterii, które są zdolne do wykorzystywania malonianu sodu jako jedynego źródła węgla oraz siarczanu amonu jako źródła azotu.

Większość Enterobacteriaceae, które nie używają malonianu, może rosnąć na tym podłożu, przyjmując dekstrozę i wyciąg z drożdży jako składniki odżywcze.

W takim przypadku każda próba alkalizacji przy użyciu peptonów zostanie zniwelowana przez produkcję kwasów powstałych w wyniku fermentacji dekstrozy. Podobnie fosforany dwupotasowe i jednopotasowe działają jako bufor, utrzymując pH na poziomie 6,7.

Dlatego w przypadku negatywnego wyniku testu bulion zachowuje ten sam oryginalny kolor (zielony). W rzadkich przypadkach pożywka może zakwasić się z powodu fermentacji dekstrozy; bez użycia peptonów i wskaźnika pH zmieniłby kolor podłoża na żółty. Aby tak się stało, pH musi spaść do 6.

Jednak gdy wynik testu jest pozytywny, mówi się, że mikroorganizm używał malonianu i siarczanu amonu jako źródeł odpowiednio węgla i azotu, bez wykorzystywania innych składników.

W tym przypadku podłoże staje się zasadowe z powodu uwolnienia sodu i wynikającego z tego tworzenia się NaOH. W tym sensie wskaźnik pH (błękit bromotymolowy) zmienia kolor pożywki z zielonego na niebieski, gdy pH jest równe lub większe niż 7,6. Niebieski może być jasny lub intensywny (błękit pruski).

Wreszcie chlorek sodu utrzymuje osmolarność podłoża, a woda jest rozcieńczalnikiem wszystkich składników.

Interpretacja

Bulion tego samego koloru (zielony) - test ujemny

Bulion żółty: wynik negatywny

Jasnoniebieski lub ciemnoniebieski bulion: wynik pozytywny

Istnieje wariant zwany bulionem z malonianem fenyloalaniny, zwanym także pożywką Shawa i Clarke'a. W takim przypadku można przeanalizować dwa testy, wykorzystanie malonianu jako źródła węgla i produkcję kwasu pirogronowego z fenyloalaniny.

Przygotowanie

Bulion malonianowy

Waży się ilość gramów określoną na wkładce wybranej firmy handlowej (może się ona różnić w zależności od). Odważone gramy zawieszono w jednym litrze wody destylowanej. Podgrzej lekko, aż do całkowitego rozpuszczenia. Rozprowadzić 3 ml pożywki do probówek 13/100 z bawełnianymi zatyczkami.

Sterylizuj w autoklawie w 121 ° C przez 15 do 20 minut.

Ostudzić przed użyciem. Jeśli nie będą one używane od razu, należy je przechowywać w lodówce do momentu użycia. Przed zaszczepieniem doprowadzić buliony do temperatury pokojowej.

PH pożywki powinno wynosić 6,7 ± 0,2. Kolor przygotowanego podłoża to zieleń butelkowa.

Bulion z malonianem fenyloalaniny

Odważyć 11 g odwodnionej pożywki i rozpuścić w 1 litrze wody destylowanej. Reszta preparatu jest taka sama, jak opisano wcześniej.

Można go również przygotować, dodając 2 g / l fenyloalaniny do pożywki z bulionem malonianowym przed sterylizacją.

Posługiwać się

Jest używany jako część zestawu testów biochemicznych, które są gromadzone w celu identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacteriaceae.

Pomaga rozróżnić:

-Rodzaj Klebsiella i Enterobacter (+) z rodzaju Escherichia i Serratia (-).

-Gatunki Salmonella enterica ssp arizonae, Salmonella enterica ssp salame i Salmonella enterica ssp diarizonae (+), z gatunku Salmonella enterica ssp enterica (-).

-Z rodzaju Klebsiella ogólnie (+) z rodzaju Actinobacillus (-).

-Okazjonalnie może pomóc w różnicowaniu rodzajów i gatunków bakterii nienależących do rodziny Enterobacteriaceae, takich jak niefermentujące pałeczki Gram-ujemne Alcaligenes faecalis (+) i Acinetobacter sp (-).

Źródło: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.

Proces

Pod zapalniczką pobiera się porcję czystej wody kolońskiej, używając odpowiednio wysterylizowanej i schłodzonej platynowej rączki. Pobrana próbka (lekki materiał inokulacyjny) jest rozpuszczana w bulionie malonianowym. Inkubować z luźną pokrywką w warunkach tlenowych w temperaturze 35 ° C ± 0,2 przez 24–48 godzin.

Bulion malonianowy można również zaszczepić z 18-24-godzinnej kultury w bulionie tryptykazowo-sojowym. W takim przypadku za pomocą sterylnej pipety pobiera się 0,01 ml i zaszczepia się bulionem malonianowym. Inkubować z luźną pokrywką w warunkach tlenowych w temperaturze 35 ° C ± 0,2 przez 24–48 godzin.

Pod koniec czasu wyniki są interpretowane. Każdy ślad niebieskiego koloru po 48 godzinach inkubacji należy uznać za pozytywny. Test nie powinien być interpretowany jako negatywny, dopóki nie upłynie 48 godzin inkubacji.

W przypadku stosowania wariantu bulionu z malonianem fenyloalaniny, najpierw interpretuje się malonian, a następnie dodaje 5 kropli 1N HCl i 3-5 kropli 8% chlorku żelazowego. Ciemnozielony kolor jest interpretowany jako dodatni wynik testu na obecność fenyloalaniny. Z drugiej strony, jeśli podłoże zmieni kolor na bladoniebieski, wynik testu na obecność fenyloalaniny jest ujemny.

QA

Aby przeprowadzić kontrolę sterylności pożywki, jeden lub dwa buliony należy inkubować w temperaturze 35 ° C ± 0,2 przez 24 godziny inkubacji. Po tym czasie nie powinno już być zmętnienia ani zmiany koloru.

Do kontroli jakości można wykorzystać znane lub certyfikowane szczepy, takie jak: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enterica ssp arizonae ATCC 13314 i Escherichia coli ATCC 25922.

Oczekiwane rezultaty to:

• Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae i Salmonella enterica ssp arizonae dają pozytywną reakcję (średnio niebieski kolor).
• W przypadku Escherichia coli wynik powinien być ujemny, to znaczy oczekuje się, że nie będzie zmiany koloru (zielony) lub zmieni kolor na żółty w wyniku fermentacji glukozy.

Ograniczenia

Nie używać bulionu, który wykazuje zmętnienie, wytrąca się, zmianę koloru lub jakiekolwiek oznaki zepsucia.

Bibliografia

1. Pedraza J, Sanandres N, Varela Z, Aguirre E, Camacho J. Mikrobiologiczna izolacja Salmonella spp. oraz molekularne narzędzia do jego wykrywania. Uninorte Health. Barranquilla (Col.) 2014; 30 (1): 73-94. Dostępne pod adresem: scielo.org.co
2. BBL. Malonate Broth, modyfikacja Ewinga. 2007. Dostępne na: bd.com
3. Senna Laboratories. Bulion Malonato. Dostępne pod adresem: cientificasenna.com
4. RenyLab. Bulion Malonato. 2013 Dostępne pod adresem: es.renylab.ind.br
5. Diagnostyka Mbiolog. Bulion Malonato. Dostępne pod adresem: mbiolog.com
6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
7. Conda Pronadisa Laboratories. Bulion z malonianem fenyloalaniny. Dostępne pod adresem: condalab.com