SZCZEP (MIKROBIOLOGICZNY): CHARAKTERYSTYKA, IDENTYFIKACJA, IZOLACJA - BIOLOGIA - 2025

Szczep mikroorganizmu jest zestaw potomstwo z jednego izolatu drobnoustrojów, które hoduje się w czystym środowisku i zazwyczaj składa się z szeregu organizmów, które pochodzą z tej samej początkowej kolonii.

Szczep reprezentuje również zbiór osobników populacji gatunku drobnoustrojów, które mają wspólne pewne cechy fenotypowe i / lub genotypowe, które nieznacznie odróżniają go od innych tego samego gatunku, ale których różnice nie wystarczają, aby sklasyfikować je jako różne gatunki.

Zdjęcie szalki Petriego ze stałą pożywką hodowlaną uzupełnioną antybiotykami, na której rosną oporne drobnoustroje (źródło: Microrao / CC BY-SA (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0) za pośrednictwem Wikimedia Commons)

Szczep jest „podstawą” wszelkich badań mikrobiologicznych, ponieważ gwarantuje naukowcom, że parametry i cechy badane na temat gatunku drobnoustroju są specyficzne tylko dla tego gatunku. Ponadto pozwala im to w pewien sposób zapewnić odtwarzalność badań.

Na przykład w przypadku badań taksonomicznych w mikrobiologii pierwszym celem jest uzyskanie „szczepu” organizmu, który ma być sklasyfikowany, ponieważ w ten sposób można precyzyjnie określić, które z cech taksonomicznych wyróżniają ten podzbiór w ramach populacji jednego gatunku lub dowolnego innego gatunku drobnoustroju.

Szczep pozwala na utrzymanie gatunku drobnoustroju przy życiu i izolację in vitro przez długi czas, czyli z dala od jego naturalnego środowiska. Można uzyskać szczepy wielu różnych typów mikroorganizmów, takich jak między innymi bakterie, grzyby, wirusy, pierwotniaki, glony.

W celu utrzymania szczepów należy je trzymać w ścisłej izolacji, co pozwala uniknąć kontaktu szczepu z jakimkolwiek czynnikiem zanieczyszczającym, takim jak zarodniki grzybów lub wszelkie zewnętrzne czynniki mikroorganizmów.

Charakterystyka szczepu

Wszystkie szczepy, niezależnie od rodzaju mikroorganizmu (gatunku), który reprezentują, muszą spełniać pewne podstawowe parametry, wśród których są:

- Muszą być stabilnymi liniami genetycznymi lub mieć wysoką wierność genetyczną

Ważne jest, aby wszystkie osobniki pozostające w pożywce hodowlanej były jak najbliżej siebie, mówiąc genetycznie. Oznacza to, że wszystkie pochodzą od tej samej osoby lub przynajmniej z tej samej populacji.

- Muszą być łatwe w utrzymaniu lub uprawie

Osoby należące do szczepu muszą być łatwe w utrzymaniu w środowisku in vitro. Innymi słowy, nie wszystkie mikroby są w stanie odizolować się od swojego naturalnego środowiska. Jeśli trudno je wyhodować na pożywkach zewnętrznych, ich biologię można łatwo zmienić przy minimalnych zmianach środowiska, w którym są trzymane w laboratorium.

- Muszą mieć szybki wzrost i rozwój w optymalnych warunkach

Jeśli izolowane drobnoustroje nie rozwijają się szybko w pożywce hodowlanej używanej do tego celu, mogą być trudne do zachowania do badań, ponieważ mogą usuwać składniki odżywcze ze swojego środowiska, zmieniać fazę lub zagrozić ich przetrwaniu w takich warunkach. .

- Muszą mieć określone cechy i parametry

Szczep izolowanych mikroorganizmów musi mieć wspólne cechy, które wiążą go w ten sam sposób i konkretnie z identycznymi z nim osobnikami. Te cechy muszą być stałe w czasie.

- Łatwy w obsłudze

Ogólnie rzecz biorąc, szczepy stosowane w rutynowych badaniach nie wymagają zbyt rygorystycznych lub skomplikowanych narzędzi lub protokołów. Gwarantuje to, że zarówno studenci, jak i nowi badacze mogą utrzymać ciągłość studiów w czasie.

ID

Identyfikacja molekularna

Istnieją różne metody identyfikacji nowo wyizolowanego szczepu. Jednak obecnie najdokładniejszą, szybką i prostą techniką określenia tożsamości prawie każdego gatunku jest analiza kilku regionów sekwencji genetycznych, które składają się na genom osobnika.

Zazwyczaj analizy te przeprowadza się przez amplifikację określonych regionów DNA techniką PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy). Techniki te różnią się w zależności od krawędzi, rodziny i rodzaju mikroorganizmu, którego tożsamość jest pożądana. Regiony te to na ogół:

- Regiony kodujące rybosomalne RNA

- Geny kodujące podjednostki białek biorące udział w oddychaniu (zwłaszcza jeśli organizm jest tlenowy)

- Region genetyczny, który koduje mikrofilamenty aktyny (część cytoszkieletu)

- Niektóre regiony genetyczne podjednostek chloroplastów lub białek, które biorą udział w fotosyntezie (dla niektórych glonów i cyjanobakterii oraz dla wszystkich roślin)

Po pomyślnej amplifikacji tych fragmentów genomu poddaje się je sekwencjonowaniu, aby określić kolejność nukleotydów tworzących te regiony genomu. Odbywa się to za pomocą technik NGS (sekwencjonowanie nowej generacji) przy użyciu specjalistycznego sprzętu zwanego sekwencerami.

Zsekwencjonowane regiony porównuje się z sekwencjami mikroorganizmów tego typu już wcześniej opisanymi, co jest możliwe dzięki wykorzystaniu np. Bazy danych zdeponowanej na stronie internetowej GenBank (https: // www. ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

Identyfikacja morfologiczna

W laboratoriach, które nie dysponują narzędziami biologii molekularnej do analizy cech genetycznych, do identyfikacji szczepów wielu mikroorganizmów stosuje się inne parametry fenotypowe. Ponownie badane cechy fenotypowe różnią się w zależności od organizmu, gromady, rodziny i rozpatrywanego gatunku. Wśród tych parametrów są badane:

- Charakterystyka morfologiczna drobnoustroju w pożywce hodowlanej. Obserwuje się między innymi takie cechy jak: kolor, kształt, konsystencja, rodzaj wzrostu.

- Analiza produktów przemiany materii za pomocą narzędzi biochemicznych. Badana jest produkcja metabolitów wtórnych, m.in. wydalanych związków chemicznych.

- Charakterystyka i krystalizacja białek. Białka wewnętrzne mikroorganizmów są ekstrahowane i badane niezależnie.

Charakterystyczne dla badań mikrobiologicznych jest charakterystyka szczepów z obydwoma rodzajami identyfikacji, czyli zarówno poprzez obserwacje morfologiczne, jak i analizę molekularną.

Izolacja szczepów

Izolacja szczepów obejmuje kilka technik, które są również wykorzystywane do oddzielania jednego gatunku drobnoustroju od drugiego. Zdolność do wyizolowania szczepu danego gatunku jest niezbędna do dokładnego określenia jego definiujących cech.

Większość technik izolacji szczepów została stworzona w XIX wieku przez ojców mikrobiologii Louisa Pasteura i Roberta Kocha. Obaj obsesyjnie dążyli do uzyskania czystych kultur komórkowych (szczepów) badanych mikroorganizmów.

Źródło: Sentebrinka / CC BY (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0) przez Wikimedia Commons

Aby uzyskać te kultury komórkowe, badacze zbadali szeroką gamę technik i narzędzi, od stosowania sterylnych wykałaczek po zmiany w składzie pożywki hodowlanej, w której badane przez nich drobnoustroje były przygotowywane do wzrostu.

Techniki izolacji szczepu

Obecnie wszystkie techniki opracowane i stosowane przez tych badaczy, a także niektóre bardziej nowoczesne, zostały zebrane w 6 różnych typach, którymi są:

- Zarysowania, zadrapania lub zadrapania : za pomocą cienkiego i ostro zakończonego narzędzia dotyka się miejsca, w którym znajduje się mikroorganizm (szczególnie w przypadku kultur hodowanych in vitro na stałym podłożu). Sterylne, bogate w składniki odżywcze podłoże stałe zostaje zarysowane końcem, którym dotknął mikroorganizm.

- Zanurzenie lub fuzja w pożywce : pobiera się małą próbkę drobnoustrojów (może być podobna do tej pobranej w poprzedniej technice) i umieszcza się w pożywce w stanie płynnym, dodaje agar w celu zestalenia i poczekaj, aż ostygnie. Kolonie będą widoczne tylko wtedy, gdy mikroorganizm jest wysoko rozwinięty.

- Rozcieńczenia seryjne : próbka z pierwotnego miejsca, w którym pobrano gatunek, jest kolejno rozcieńczana w jałowym podłożu wolnym od innych mikroorganizmów. Rozcieńczenia wysiewa się na pożywki stałe i oczekuje się, że pojawią się kolonie.

- Ekskluzywne pożywki hodowlane : są to pożywki hodowlane, które umożliwiają wzrost tylko tego typu drobnoustroju, który jest przedmiotem zainteresowania; to znaczy zawiera składniki lub składniki odżywcze, które pozwalają jedynie na izolację wzrostu szczepu.

- Separacja ręczna lub mechaniczna : umieszcza się niewielką próbkę drobnoustroju, który ma być wyizolowany, i przy pomocy mikroskopu podejmuje się próbę oddzielenia pojedynczego osobnika gatunku od reszty osobników, które go otaczają.

Niektóre z tych technik są łatwiejsze w użyciu niż inne. Jednak badacze używają ich zgodnie z biologicznymi cechami badanego gatunku.

Bibliografia

1. De Kruif, P. (1996). Łowcy mikroorganizmów. Houghton Mifflin Harcourt.
2. Dijkshoorn, L., Ursing, BM i Ursing, JB (2000). Szczep, klon i gatunek: komentarze do trzech podstawowych pojęć bakteriologicznych. Journal of medical microbiology, 49 (5), 397-401.
3. Marx, V. (2016). Mikrobiologia: droga do identyfikacji poziomu szczepu. Nature Methods, 13 (5), 401-404.
4. Willey, JM, Sherwood, L. i Woolverton, CJ (2009). Zasady mikrobiologii Prescotta. Boston (MA): McGraw-Hill Higher Education.
5. Williams, JA (red.). (2011). Strain engineering: methods and protocols (Vol. 765, str. 389-407). Nowy Jork: Humana Press.