CYTOGENETYKA: HISTORIA, CZYM SIĘ BADA, TECHNIKI, ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2025

Cytogenetyczne jest badanie morfologii, struktury i funkcji chromosomów, w tym ich zmiany w czasie podziału komórek somatycznych, czy mitozę i podział komórki w rozrodczości lub mejozy.

Cytologia bada również czynniki powodujące zmiany chromosomalne, w tym patologiczne, które pojawiają się z pokolenia na pokolenie, oraz ewolucyjne, które działają przez wiele pokoleń.

Źródło: pixabay.com

Historia

Pamiętne lata i wydarzenia w historii cytogenetyki są następujące:

- W 1842 roku Karl Wilhelm von Nägeli zaobserwował „przejściowe komórki macierzyste”, zwane później chromosomami.

- W 1875 roku Eduard Strasburger zidentyfikował chromosomy w roślinach. W 1979 roku Walther Flemming zrobił to na zwierzętach. Flemming ukuł terminy chromatyna, profaza, metafaza, anafaza i telofaza.

- W 1888 roku W. Waldeyer ukuł termin chromosom.

- W 1893 roku Oscar Hertwig opublikował pierwszy tekst o cytogenetyce.

- W 1902 roku Theodor Boveri i Walter Sutton odkryli homologiczne chromosomy.

- W 1905 roku Nettie Stevens zidentyfikowała chromosom Y.

- W 1937 roku Albert Blakeslee i AG Avery zatrzymali metafazę kolchicyną, znacznie ułatwiając obserwację chromosomów.

- W 1968 r. Torbjörn Caspersson i współpracownicy opisali zespoły Q. W 1971 r. Bernard Dutrillaux i Jerome Lejeune opisali pasma R.

- W 1971 roku prążki C były omawiane na konferencji poświęconej nazewnictwu ludzkich chromosomów.

- W 1975 roku C. Goodpasture i SE Bloom opisali barwienie Ag-NOR.

- W 1979 roku Jorge Yunis opisał metody wysokiej rozdzielczości dla pasm G.

- W latach 1986–1988 Daniel Pinkel i Joe Gray opracowali technikę FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ).

- W 1989 roku Hermann - Josef Lüdecke poddał mikrorozcinaniu chromosomy.

- W 1996 roku Evelyn Schröck i Thomas Ried opisali multichromatyczne spektralne typowanie kariotypowe.

Odkrycia u ludzi

W 1914 roku Theodor Boveri zasugerował, że rak może być spowodowany zmianami chromosomowymi. W 1958 roku Charles E. Ford zaobserwował nieprawidłowości chromosomalne podczas białaczki.

W 1922 roku Theophilus Painter opublikował, że ludzie mają 48 chromosomów. Dopiero w 1956 roku Jo Hin Tjio i Albert Levan ustalili, że faktycznie mają 46 chromosomów.

W 1932 roku PJ Waardenburg zasugerował, nie udowadniając tego, że zespół Downa może być wynikiem aberracji chromosomowej. W 1959 roku Jerome Lejeune wykazał obecność dodatkowego chromosomu somatycznego u pacjentów z zespołem Downa.

Również w 1959 roku Charles E. Ford poinformował, że kobiety z zespołem Turnera nie mają jednego z dwóch chromosomów X, podczas gdy Patricia Jacobs i John Strong odkryli obecność dodatkowego chromosomu X u mężczyzn z zespołem Klinefeltera.

W 1960 roku JA Böök i Berta Santesson opisali triploidię, Klaus Patau opisał trisomię 13, a John Edwards opisał trisomię 18.

W 1969 roku Herbert Lubs jako pierwszy odkrył zespół łamliwego chromosomu X. W tym samym roku do diagnostyki cytogenetycznej zaczęto stosować amniopunkcję.

Kierunek studiów

Cytogenetycy badają ewolucję chromosomów żywych istot, używając kariotypów do analizy filogenetycznej i rozwiązywania problemów taksonomicznych.

Ponadto badają aspekty epidemiologiczne ludzkich aberracji chromosomowych i czynniki środowiskowe, które je wywołują, diagnozują i leczą pacjentów dotkniętych nieprawidłowościami chromosomowymi oraz opracowują molekularne metody rozszyfrowania struktury, funkcji i ewolucji chromosomów.

Morfologia chromosomów

Każdy chromosom składa się z dwóch chromatyd, utrzymywanych razem przez zwężenie zwane centromerem. Odcinki chromosomu rozpoczynające się od centromeru nazywane są ramionami.

Chromosomy nazywane są metacentrycznymi, gdy mają centromer w środku; submetacentryczny, jeśli mają go nieco od środka, tak że przeciwległe ramiona nie mają równej długości; akrocentryczny, jeśli centromer znajduje się blisko jednej z ekstremów; i telocentrycznie, jeśli centromer znajduje się tylko na jednym końcu chromosomu.

Techniki: przetwarzanie próbek

Kroki, które należy podjąć w celu przetworzenia próbek, są następujące.

Uzyskanie próbki

Pozyskanie wymaganej tkanki, przechowywanie jej w pożywce i odpowiednich fiolkach.

Kultura

Z wyjątkiem próbek do analizy FISH, przed zbiorem wymagany jest okres hodowli od jednego dnia do kilku tygodni.

Zebrane

To pozyskiwanie komórek w metafazie.

Zatrzymanie mitozy

Standardowa analiza cytogenetyczna wymaga zatrzymania mitozy, aby komórki pozostały w metafazie przy użyciu kolchicyny lub Colcemid®.

Leczenie hipotoniczne

Zwiększa objętość komórek, co umożliwia rozszerzenie chromosomów.

Utrwalenie

Metanol - kwas octowy 3: 1 służy do usuwania wody z komórek, utwardzania błon oraz chromatyny do barwienia.

Przygotowanie arkusza

Utrwalone komórki rozprowadza się na szkiełkach mikroskopowych, po czym suszy.

Barwienie chromosomami

Istnieje kilka metod barwienia służących do rozpoznawania różnic między chromosomami. Najczęstszym jest G.

Analiza mikroskopowa

Pozwala wybrać odpowiednie komórki do obserwacji i fotografowania chromosomów.

Sporządzanie kariogramów

Na podstawie zdjęć komórek w metafazie, obrazy zestawu chromosomów reprezentatywnej komórki są tworzone do późniejszych badań.

Pasma chromosomowe

Istnieją cztery typy pasm chromosomowych: pasma heterochromatyczne; pasma euchromatyczne, regiony organizujące jąderko (NOR); kinetochory.

Pasma heterochromatyczne pojawiają się jako dyskretne bloki. Odpowiadają one heterochromatynie, która zawiera wysoce powtarzalne sekwencje DNA reprezentujące konwencjonalne geny i nie ulegają dekondensacji na granicy faz.

Pasma euchromatyczne składają się z szeregu naprzemiennych segmentów, które są lub nie są poddawane barwieniu. Te prążki różnią się wielkością, tworząc charakterystyczne wzory charakterystyczne dla każdej pary chromosomów danego gatunku, co czyni je bardzo przydatnymi do identyfikacji translokacji i rearanżacji chromosomów.

NOR to te segmenty chromosomów, które zawierają setki lub tysiące genów rybosomalnego RNA. Są one powszechnie wizualizowane jako zwężenia.

Kinetochory to miejsca wiązania wrzeciona mikrotubuli z chromosomami.

Barwienie pasm chromosomowych

Prążkowanie chromosomów składa się z technik barwienia, które ujawniają wzorce podłużnego zróżnicowania (obszary jasne i ciemne), których inaczej nie można było zobaczyć. Wzorce te umożliwiają porównywanie różnych gatunków oraz badanie zmian ewolucyjnych i patologicznych na poziomie chromosomów.

Metody pasmowania chromosomów dzielą się na te, które wykorzystują barwienie absorpcyjne, zazwyczaj pigmenty Giemsa, oraz te, które wykorzystują fluorescencję. Metody barwienia absorpcyjnego wymagają wstępnej obróbki fizykochemicznej, jak opisano w części „Przetwarzanie próbki”.

Niektóre typy prążków pozwalają na stwierdzenie wzorców ograniczonych regionów chromosomów związanych z właściwościami funkcjonalnymi. Inne pozwalają na wizualizację różnic między homologicznymi chromosomami, które umożliwiają identyfikację segmentów.

Pasma C.

Pasmo C barwi większość pasm heterochromatycznych, co czyni go uniwersalną techniką pokazania obecności heterochromatyny w chromosomach. Inne metody barwią tylko część całkowitej heterochromatyny, co czyni je bardziej użytecznymi niż prążki C do rozróżniania typów heterochromatyny.

Zespoły Q.

Q-banding to najstarsza technika barwienia. Swoją nazwę zawdzięcza zastosowaniu chinakryny. Jest skuteczny niezależnie od metody przygotowania chromosomów. Jest to metoda alternatywna dla opasek G. Jest rzadko stosowana, ale jej niezawodność sprawia, że ​​jest przydatna, gdy materiału jest mało lub trudno go okleić.

Pasma G.

Obecnie najczęściej używa się pasma G, opartego na zastosowaniu Giemsy i trypsyny. Umożliwia wykrywanie translokacji, inwersji, delecji i duplikacji. Jest to najczęściej stosowana metoda charakteryzacji kariotypów kręgowców, wykazująca różnice między chromosomami, których nie można odróżnić jedynie na podstawie ich morfologii.

Zespoły R.

Pasmo R tworzy odwrotny wzór zabarwienia w stosunku do pasma G (jasne pasma R oznaczają ciemne pasma G i odwrotnie). Pasmo R jest szczególnie przydatne do podkreślania końców chromosomów, które są lekko zabarwione, gdy używane jest pasmo G.

Taśmy T.

Prążek T jest wariantem prążka R, w którym nie ma barwienia większości prążków śródmiąższowych chromosomów, tak że końcowe regiony chromosomów są intensywnie zabarwione.

Zespoły Ag-NOR

Pasy Ag-NOR są używane do lokalizacji NOR poprzez barwienie srebrem. W prążkowaniu Ag-NOR nieaktywne geny NOR mogą nie zostać wybarwione. Dlatego to prążkowanie jest wykorzystywane do badania zmian w aktywności genów rybosomalnych podczas gametogenezy i rozwoju embrionalnego.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)

Prążkowanie FISH umożliwia wizualizację chromosomów przy użyciu sond znakowanych fluorescencyjnie. Technologia FISH umożliwia analizę kariotypową komórek, które się nie dzielą.

Prążkowanie FISH pozwala na wykrycie określonych sekwencji DNA w chromosomach, komórkach i tkankach. Dlatego może być stosowany do wykrywania anomalii chromosomalnych, które obejmują małe segmenty DNA.

Paskowanie FISH utorowało drogę dla dwóch bardziej wyrafinowanych pokrewnych technik, znanych jako kariotypowanie spektralne (SKY) i wielokolorowe FISH (M-FISH).

W SKY i M-FISH stosowane są barwniki fluorescencyjne, które razem tworzą kombinacje kolorów, po jednym dla każdego chromosomu. Techniki te okazały się bardzo przydatne w wykrywaniu złożonych aberracji chromosomalnych, takich jak te obserwowane w niektórych nowotworach oraz w ostrej białaczce limfoblastycznej.

Zastosowania medyczne

- Cytogenetyka raka. Aberracje chromosomalne i aneuploidie są częste w guzach. Translokacje chromosomów mogą mieć działanie rakotwórcze poprzez produkcję białek fuzyjnych. Cytogenetyka służy do monitorowania postępu leczenia raka.

- Wrażliwe miejsca i złamania chromosomów. Wrażliwe miejsca chromosomów mogą prowadzić do patologii, takich jak zespół łamliwego chromosomu X. Narażenie na środki cytotoksyczne może spowodować złamanie chromosomu. Nosiciele niektórych mutacji autosomalnych nie mają zdolności do naprawy DNA uszkodzonego podczas złamania chromosomu.

- Nieprawidłowości numeryczne chromosomów. Liczba chromosomów może zdiagnozować trisomie, takie jak ta, która powoduje zespoły Downa, Edwardsa i Patau. Pozwala także na rozpoznanie zespołów Turnera i Klinefeltera.

- W przewlekłej białaczce szpikowej białe krwinki mają „chromosom Philadelphia”. Ten nieprawidłowy chromosom jest wynikiem translokacji chromosomów 9 i 22.

Bibliografia

1. Abbott, JK, Nordén, AK, Hansson, B. 2017. Ewolucja chromosomów płci: spostrzeżenia historyczne i perspektywy na przyszłość. Proceedings of the Royal Society B, 284, 20162806.
2. Cregan, ERC 2008. Wszystko o mitozie i mejozie. Publikacja materiałów stworzonych przez nauczyciela, Huntington Beach, CA.
3. Gersen, SL, Keagle, MB, wyd. 2013. Zasady cytogenetyki klinicznej. Springer, Nowy Jork.
4. Gosden, JR, wyd. 1994. Metody w biologii molekularnej, tom 29. Protokoły analizy chromosomów. Humana Press, Totowa, NJ
5. Hughes, JF, Page, DC 2015. Biologia i ewolucja chromosomów Y ssaków. Annual Review of Genetics, 49, 22.1–22.21.
6. Kannan, TP, Alwi, ZB 2009. Cytogenetyka: przeszłość, teraźniejszość i przyszłość. Malezyjski dziennik nauk medycznych, 16, 4–9.
7. Lawce, HJ, Brown, MG 2017. Cytogenetyka: przegląd. W: The AGT Cytogenetics Laboratory Manual, wydanie czwarte. Arsham, MS, Barch, MJ, Lawce, HJ, wyd. Wiley, Nowy Jork.
8. Sacerdot, C., Louis, A., Bon, C., Berthelot, C., Crollius, HR 2018. Ewolucja chromosomów u źródła genomu przodków kręgowców. Genome Biology, 19, 166.
9. Schubert, I. 2007. Ewolucja chromosomów. Current Opinion in Plant Biology, 10, 109–115.
10. Schulz-Schaeffer, J. 1980. Cytogenetyka - rośliny, zwierzęta, ludzie. Springer-Verlag, Nowy Jork.