DAPI (4 ', 6-DIAMIDINO-2-FENYLOINDOL): CHARAKTERYSTYKA, UZASADNIENIE, ZASTOSOWANIE - CHEMIA - 2026

DAPI (4”, 6-diamidyno-2-fenyloindolu) jest barwnikiem fluorescencyjnym przez właściwości służy do znacznika, powszechnie stosowane w tej dziedzinie techniki mikroskopii fluorescencyjnej lub cytometrii przepływowej, między innymi. Emitowana przez nią fluorescencja jest jasnoniebieska, jej wzbudzenie zachodzi między 455-461 nm (światło UV).

Barwnik DAPI może z dużą łatwością przechodzić przez błonę komórkową martwych komórek. Może również zabarwić jądra żywych komórek, ale w tym przypadku stężenie tego musi być wyższe.

Struktura chemiczna barwnika fluorescencyjnego DAPI. Źródło: Image: File: DAPI.svg jest wektorową wersją tego pliku. Powinien być używany zamiast tego obrazu rastrowego, jeśli nie jest gorszy / Obraz po edycji Richard Wheeler (Zephyris)

Barwnik jest zdolny do dostępu do DNA komórkowego, do którego ma szczególne powinowactwo, wiążąc się z wielką zachłannością z zasadami azotowymi adeniny i tyminy. Z tego powodu jest bardzo przydatny w niektórych technikach biologii molekularnej.

Związek ten należy do grupy barwników indolowych i wykazano, że ma większą wrażliwość na DNA niż bromek etydyny i jodek propidyny, zwłaszcza na żelach agarozowych.

Zastosowanie tego barwnika fluorescencyjnego jest bardzo szerokie, ponieważ jest użyteczny do: badania zmian w DNA w procesach apoptotycznych (śmierć komórki), a tym samym wykrywania komórek w tym procesie; w przypadku zdjęć przedstawiających ślad DNA (drukowanie zdjęć DNA); badanie skażenia bakteryjnego; lub wizualizacji segmentacji jądrowej.

Został również wykorzystany w badaniach prążków chromosomalnych, w wykrywaniu DNA mykoplazm sp, w interakcji DNA-białko, w barwieniu i liczeniu komórek metodą immunofluorescencji, a nawet do barwienia dojrzałych ziaren pyłku.

cechy

DAPI to skrót od jego nazwy chemicznej (4 ', 6-diamidino-2-fenyloindol). Jego wzór cząsteczkowy to C ₁₆ H ₁₅ N _5. Ma masę cząsteczkową 350,3. W pobliżu zakresu światła UV (345 do 358 nm) zachodzi maksymalne wzbudzenie kompleksu DAPI-DNA, podczas gdy maksymalna emisja fluorescencji występuje między 455-461 nm.

Barwnik ten charakteryzuje się żółtym proszkiem, ale struktury oznaczone tym fluoroforem emitują jasnoniebieskie światło.

Jest to związek rozpuszczalny w wodzie, jednak w celu przyspieszenia jego rozpuszczania można zastosować trochę ciepła. Można go rozcieńczyć PBS, ale nie rozpuszcza się w nim bezpośrednio.

Po przygotowaniu barwnik należy go przechowywać w ciemności, czyli chronić przed światłem, w temperaturze od 2 do 8 ° C (lodówka). W tych warunkach barwnik jest stabilny dłużej niż 3 tygodnie lub miesiące.

Jeśli jest chroniony przed światłem, ale pozostawiony w temperaturze pokojowej, jego stabilność spada do 2 lub 3 tygodni, ale wystawiony na bezpośrednie działanie światła, niszczenie jest bardzo szybkie. Jeśli chcesz przechowywać go znacznie dłużej, możesz przechowywać go w lodówce w temperaturze -20 ° C, rozprowadzając w porcjach.

Podstawa

Barwienie to opiera się na generowaniu jądrowego barwienia kontrastowego w głównych technikach biologii molekularnej, takich jak między innymi: cytometria przepływowa, mikroskopia fluorescencyjna i barwienie chromosomów metafazowych lub jąder międzyfazowych.

Technika ta opiera się na dużym powinowactwie barwnika do zasad azotowych (adeniny i tyminy) zawartych w materiale genetycznym (DNA) w mniejszym rowku. Na poziomie cytoplazmatycznym pozostawia bardzo małe tło.

Gdy barwnik fluorescencyjny wiąże się z regionami DNA adeniny i tyminy, fluorescencja znacznie wzrasta (20 razy więcej). Emitowany kolor to jasnoniebieski. Warto zauważyć, że nie ma emisji fluorescencji przy wiązaniu z parami zasad GC (guanina-cytozyna).

Należy zauważyć, że chociaż ma również powinowactwo do RNA, nie powoduje to problemu, ponieważ najwyższy stopień emisji energii z tej cząsteczki występuje przy innej długości fali (500 nm), w przeciwieństwie do DNA, który robi to przy 460 nm. Ponadto wzrost fluorescencji po związaniu z RNA wynosi tylko 20%.

DAPI jest używany bardziej do barwienia martwych (utrwalonych) komórek niż komórek żywych, ponieważ do barwienia tego ostatniego potrzebne jest znacznie wyższe stężenie barwnika, ponieważ błona komórkowa jest znacznie mniej przepuszczalna dla DAPI za życia.

Barwnik DAPI można stosować w połączeniu z czerwonymi i zielonymi fluoroforami, aby uzyskać wielokolorowe wrażenia.

Posługiwać się

DAPI (4 ', 6-diamidyno-2-fenyloindol) jest doskonałym fluoroforem i dlatego jest szeroko stosowany w różnych technikach i do różnych celów. Poniżej wyjaśniono użycie DAPI w głównych technikach.

Cytometrii przepływowej

Badacze Gohde, Schumann i Zante w 1978 roku jako pierwsi zastosowali i zaproponowali DAPI jako fluorofor w technice cytometrii przepływowej, odnosząc wielki sukces ze względu na jego wysoką czułość na DNA i wysoką intensywność emisji fluorescencji.

Zastosowanie DAPI w tej technice pozwala na badanie cyklu komórkowego, kwantyfikację komórek oraz barwienie żywych i martwych komórek.

Chociaż istnieją inne barwniki, takie jak bromek etydyny, tlenek Hoechsta, oranż akrydyny i jodek propidyny, DAPI jest jednym z najpowszechniej stosowanych, ponieważ jest bardziej fotostabilny niż te wymienione wcześniej.

Do tej techniki wymagane jest utrwalenie komórek, w tym celu można użyć absolutnego etanolu lub 4% paraformaldehydu. Próbkę odwirowuje się, a supernatant odrzuca, a następnie komórki nawadnia się przez dodanie 5 ml buforu PBS na 15 minut.

W miarę upływu czasu przygotuj barwnik DAPI za pomocą buforu do barwienia (FOXP3 firmy BioLegend) o stężeniu 3 µM.

Odwirować próbkę, odrzucić supernatant, a następnie przykryć 1 ml roztworu DAPI na 15 minut w temperaturze pokojowej.

Przenieś próbkę do cytometru przepływowego za pomocą odpowiedniego lasera.

Mikrofluorometria przepływowa

Inną techniką, w której stosuje się DAPI, jest mikro-fluorometria przepływowa wraz z innym fluoroforem zwanym mitramycyną. Oba są przydatne do indywidualnego oznaczania ilościowego DNA chloroplastu, ale DAPI najlepiej nadaje się do pomiaru cząstek bakteriofaga T4.

Hybrydyzacja

Ta technika zasadniczo wykorzystuje sondy DNA znakowane barwnikiem fluorescencyjnym, którym może być DAPI.

Próbka wymaga obróbki cieplnej w celu zdenaturowania dwuniciowego DNA i przekształcenia go w dwie jednoniciowe nici. Następnie hybrydyzuje się z wyznakowaną DAPI denaturowaną sondą DNA, która ma interesującą sekwencję.

Później jest myte, aby wyeliminować to, co nie zostało zhybrydyzowane, a do wizualizacji DNA stosuje się kontrast. Mikroskop fluorescencyjny umożliwia obserwację zhybrydyzowanej sondy.

Technika ta ma na celu wykrywanie określonych sekwencji w chromosomalnym DNA, umożliwiając diagnozowanie pewnych chorób.

Te techniki cytomolekularne były bardzo pomocne w określaniu szczegółów badań kariotypów. Na przykład wykazał bogate w pary zasad regiony adenozyny i tyminy zwane regionami heterochromatycznymi lub pasmami DAPI.

Technika ta jest szeroko stosowana w badaniach chromosomów i chromatyny u roślin i zwierząt, a także w diagnostyce patologii prenatalnych i hematologicznych u ludzi.

W tej technice zalecane stężenie DAPI wynosi 150 ng / ml przez 15 minut.

Zmontowane szkiełka powinny być chronione przed światłem w temperaturze 2-8 ° C.

Barwienie immunofluorescencyjne

Komórki utrwalono 4% paraformaldehydem. Jeśli mają być użyte inne barwienia, na końcu pozostawia się DAPI jako barwnik kontrastowy, a komórki przykrywa się roztworem PBS na 15 minut. W miarę upływu czasu przygotować roztwór DAPI rozcieńczając go PBS, tak aby końcowe stężenie wynosiło 300 µM.

Następnie usuwa się nadmiar PBS i przykrywa DAPI na 5 minut. Myje kilka razy. Szkiełko ogląda się pod mikroskopem fluorescencyjnym pod odpowiednim filtrem.

Karta bezpieczeństwa

Z tym związkiem należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ jest to związek o właściwościach mutagennych. Węgiel aktywny służy do usuwania tego związku z roztworów wodnych, które mają zostać odrzucone.

Aby uniknąć wypadków z tym odczynnikiem, należy używać rękawiczek, fartucha i okularów ochronnych. Jeśli dojdzie do kontaktu ze skórą lub błoną śluzową, miejsce to należy przemyć odpowiednią ilością wody.

Nigdy nie należy pipetować tego odczynnika ustami, należy używać pipet.

Nie zanieczyszczać odczynnika środkami drobnoustrojowymi, ponieważ spowoduje to błędne wyniki.

Nie rozcieńczaj plamy DAPI bardziej niż jest to zalecane, gdyż znacznie obniży to jakość plamy.

Nie wystawiaj odczynnika na bezpośrednie działanie światła ani nie trzymaj go w cieple, ponieważ zmniejsza to fluorescencję.

Bibliografia

1. Brammer S, Toniazzo C i Poersch L. Corantes powszechnie zaangażowani w cytogenetykę roślin. Arq. Inst. Biol. 2015, 82. Dostępne w: scielo.
2. Impath Laboratories. DAPI. Dostępne pod adresem: menarinidiagnostics.com/
3. Laboratoria cytocell. 2019. Instrukcja korzystania z DAPI. dostępne na cytocell.com
4. Elosegi A, Sabater S. Pojęcia i techniki w ekologii rzek. (2009). Redakcja Rubes, Hiszpania. Dostępne pod adresem: books.google.co.ve/
5. Novaes R, Penitente A, Talvani A, Natali A, Neves C, Maldonado I. Zastosowanie fluorescencji w zmodyfikowanej metodzie dyssektora do oszacowania liczby miocytów w tkance serca. Arch. Bras. Cardiol. 2012; 98 (3): 252–258. Dostępne w: scielo.
6. Rojas-Martínez R, Zavaleta-Mejía E, Rivas-Valencia P. Obecność fitoplazm w papai (Carica papaya) w Meksyku. Magazyn Chapingo. Seria ogrodnicza, 2011; 17 (1), 47-50. Dostępne pod adresem: scielo.org.