TEST KATALAZY: UZASADNIENIE, TECHNIKA I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2025

Test katalazy jest metodologią stosowaną w laboratoriach bakteriologicznych w celu wykrycia obecności enzymu katalazy w bakteriach, które go posiadają. Wraz z barwieniem Grama są to główne testy, które należy wykonać na nowo wyizolowanych mikroorganizmach. Testy te prowadzą mikrobiologa do kroków, które należy wykonać w celu ostatecznej identyfikacji danego mikroorganizmu.

Ogólnie rzecz biorąc, bakterie zawierające cytochrom mają enzym katalazę, to znaczy bakterie tlenowe i fakultatywnie beztlenowe powinny go mieć. Są jednak wyjątki, takie jak Streptococcus, które pomimo tego, że są fakultatywnie beztlenowymi mikroorganizmami, nie posiadają enzymu katalazy.

Przeprowadzenie testu katalazy, wykazujące pozytywną reakcję. Źródło: nie podano autora do odczytu maszynowego. Założono Nase (na podstawie roszczeń dotyczących praw autorskich).

Z tego powodu test na katalazę służy przede wszystkim do rozróżnienia rodzin Staphylococaceae i Micrococaceae (obie katalazy dodatnie) od rodziny Streptococaceae (katalazy ujemne).

Podobnie, między innymi rodzaj Bacillus (pozytywny pod względem katalazy) różni się od rodzaju Clostridium (ujemny pod względem katalazy).

Podstawa

Katalaza jest enzymem zaliczanym do hydronadoksydazy, co oznacza, że ​​jako substrat wykorzystują nadtlenek wodoru (H ₂ O ₂ ).

Jest również uważana za oksydoreduktazę, ponieważ w reakcji, w której uczestniczy, występuje pierwiastek, który służy jako donor elektronów (substancja redukująca), a inny jako receptor elektronów (substancja utleniająca).

Katalaza jest białkiem zawierającym grupę proseryczną z czterema trójwartościowymi atomami żelaza (Fe ⁺⁺⁺ ), dlatego jest homoproteiną. Jon żelazowy pozostaje utleniony podczas reakcji.

Można powiedzieć, że katalaza jest enzymem odtruwającym, gdyż jego funkcją jest eliminacja toksycznych dla bakterii substancji wytwarzanych podczas metabolizmu bakterii. Wśród tych substancji jest nadtlenek wodoru.

Nadtlenek wodoru powstaje w wyniku tlenowego rozkładu cukrów. Ten proces przebiega w następujący sposób:

Jon ponadtlenkowy (O ₂ ^- ) (wolny rodnik) powstaje jako końcowy produkt asymilacji glukozy drogą tlenową. Jest to toksyczne i jest eliminowane przez enzym dysmutazę ponadtlenkową, która przekształca go w gazowy tlen i nadtlenek wodoru.

Nadtlenek wodoru jest również toksyczny dla bakterii i należy go usunąć. Enzym katalaza rozkłada nadtlenek wodoru na wodę i tlen.

Katalaza może działać na substraty inne niż nadtlenek wodoru, takie jak alkohole, aldehydy, kwasy, aminy aromatyczne i fenole. Jednak nadtlenek wodoru może być również stosowany przez katalazę do utleniania innych toksycznych związków, takich jak alkohol metylowy i etylowy.

Podobnie katalaza jest obecna w komórkach fagocytarnych, chroniąc ją przed toksycznym działaniem nadtlenku wodoru.

Rutynowa technika testu katalazy

-Slide metoda

materiały

3% nadtlenek wodoru (10 objętości).

Slajd mikroskopowy

Jednorazowy plastikowy uchwyt lub drewniana wykałaczka.

Proces

Weź wystarczającą ilość kolonii do badań bez dotykania agaru, z którego pochodzi. Kolonia musi być świeża, to znaczy pochodzić z kultury trwającej od 18 do 24 godzin.

Umieścić kolonię na suchym szkiełku i dodać do niej kroplę 3% nadtlenku wodoru (można również użyć 30% H ₂ O ₂ ). Natychmiast obserwuj, czy pęcherzyki są uwalniane.

Interpretacja

Reakcja pozytywna: wydzielanie się gazu, widoczne w postaci pęcherzyków (silne bulgotanie).

Reakcja negatywna: brak tworzenia się pęcherzyków.

-Metoda bezpośrednia w czystej kulturze

Umieść 1 ml 3% H ₂ O ₂ na czystej płytce lub kulturze klinowej, która nie zawiera krwi (najlepiej agar odżywczy). Natychmiast obserwuj, czy nie powstają pęcherzyki. Można również użyć 30% H ₂ O ₂ .

Jest interpretowana tak samo, jak metoda obiektowa porta.

-Metoda z kapilarą lub Fung i Petrishko

Wypełnij kapilarę o średnicy 67 mm do wysokości 20 mm 3% roztworem nadtlenku wodoru metodą kapilarną.

Dotknąć izolowanej kolonii, która ma być badana, kapilarą wypełnioną 3% H ₂ O _{2 .} Obserwuj, czy kapilara wypełnia się bąbelkami w ciągu około 10 sekund. Ta metoda pozwala na półilościowe oznaczenie reakcji w krzyżykach:

Bez krzyżyków nie ma bąbelków (reakcja negatywna).

+ ---- Kilka pęcherzyków (słaba lub opóźniona reakcja).

++ --– Obfite bąbelki (reakcja umiarkowana).

+++ - Bąbelki osiągają przeciwny koniec (silna reakcja).

-Taylor i Achanzar metoda testów katalazy, które dają wątpliwe

Umieścić izolowaną kolonię na czystym, suchym szkiełku, następnie umieścić kroplę 0,5% H ₂ O ₂ i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Obserwuj, czy nie tworzą się uwięzione pęcherzyki.

Interpretacja: obecność pęcherzyków wskazuje na pozytywną reakcję. Brak pęcherzyków, jest to interpretowane jako reakcja negatywna.

Test katalazy dla gatunków Mycobacterium

Tę technikę należy wykonać kontrolując pH i temperaturę. Musi być przeprowadzane pod wyciągiem z przepływem laminarnym, ponieważ manipulowanie różnymi gatunkami Mycobacterium jest niebezpieczne.

-Materiały

Nadtlenek wodoru 30% lub 110 objętości (ponadtlen).

Bufor fosforanowy pH 7

10% Tween 80

Hodowla klinowa Mycobacterium przez 3 do 4 tygodni

-Przygotowanie

Bufor fosforanowy pH 7

Ważyć:

1,361 g bezwodnego fosforanu monopotasowego (KH ₂ PO ₄ ).

1,420 g bezwodnego fosforanu disodu (Na2HPO3).

Obie sole rozpuścić w niewielkiej ilości sterylnej wody destylowanej i uzupełnić wodą do 1000 ml.

10% Tween 80

Rozcieńczyć w stosunku 1:10 Tween 80, który jest komercyjnie stężony, w tym celu postępować w następujący sposób:

Weź 1 ml Tween 80 i umieść go w niewielkiej ilości wody destylowanej, rozpuść, a następnie uzupełnij objętość wodą do 10 ml.

Odczynnik końcowy

Zmieszać pewną ilość buforu fosforanowego z ilością 10% Tween 80 (równe części). Określ w laboratorium, ile chcesz przygotować.

-Proces

Umieścić 5 ml buforu fosforanowego w sterylnej probówce z zakrętką (bakelit).

Za pomocą pętli zaszczepiającej weź wystarczającą ilość kolonii Mycobacterium zaszczepionej w ćwiartkach i rozpuść w buforze fosforanowym.

Zakryj rurkę bez nadmiernego dokręcania gwintu. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 68 ° C na 20 do 30 minut. Wyjmij i ostudź do 22-25 ° C

Odmierz 0,5 ml końcowego odczynnika (wymieszaj) i dodaj go do probówki z zimnym roztworem. Obserwuj tworzenie się pęcherzyków lub ich brak.

Jest interpretowany tak samo, jak poprzednie techniki.

Posługiwać się

Po uzyskaniu wzrostu kolonii we wzbogaconej pożywce należy na otrzymanych koloniach wykonać barwienie metodą Grama i test katalazy. To wskaże mikrobiologowi procedury, których należy przestrzegać w celu ostatecznej identyfikacji.

Źródło: oprac. Mgr inż. Marielsa gil

QA

Aby ocenić dobre działanie odczynnika nadtlenku wodoru, należy użyć świeżo wyhodowanych szczepów kontrolnych, takich jak Staphylococcus aureus jako kontroli pozytywnej i szczepów Streptococcus sp jako kontroli negatywnej.

Inną alternatywą, która służy jako kontrola pozytywna, jest umieszczenie kropli nadtlenku wodoru na agarze z krwią, erytrocyty mają katalazę, dlatego będzie bulgotanie, jeśli odczynnik jest w dobrym stanie.

Agar czekoladowy może być użyty jako kontrola negatywna, tutaj erytrocyty są już zlizowane i wynik testu jest negatywny.

Ograniczenia

-Nie używaj do testu starych kultur, ponieważ może to spowodować fałszywie ujemne wyniki.

-Unikaj pobierania kolonii z posiewów na agarze z krwią, uważając, aby nie dotykać agaru; Ta procedura może prowadzić do fałszywie dodatnich wyników, ponieważ czerwone krwinki zawierają katalazę.

-Jeśli bierzesz kolonię z platynowym uchwytem, ​​nie odwracaj kolejności procedury, ponieważ może to generować fałszywe alarmy. Dzieje się tak, ponieważ platyna może reagować z nadtlenkiem wodoru, powodując bulgotanie.

-Nie używaj odczynnika nadtlenku wodoru, jeśli jest bardzo stary, ponieważ odczynnik jest bardzo niestabilny i ma tendencję do rozkładania się z czasem.

-Trzymaj odczynnik nadtlenku wodoru chroniony przed światłem i przechowywany w lodówce, aby zapobiec uszkodzeniom.

-Przeprowadź kontrolę jakości odczynnika nadtlenku wodoru za każdym razem, gdy jest używany.

- Należy wziąć pod uwagę, że jeśli stosuje się 30% H ₂ O ₂ , reakcje są silniejsze niż te, które prowadzi się z 3% H ₂ O ₂ .

Bibliografia

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne do identyfikacji bakterii o znaczeniu klinicznym. 3rd ed. Od redakcji Panamericana. Buenos Aires. Argentyna.
4. BD Laboratories. Odczynnik Catalase-Gotario. Dostępne pod adresem: http://winklerltda.cl
5. Vadequímica Laboratories. Nadtlenek. Równoważność między objętościami a procentami. Dostępne pod adresem: vadequimica.com