ENDONUKLEAZY: FUNKCJE, TYPY I PRZYKŁADY - BIOLOGIA - 2026

W endonukleazy to enzymy, które tną wiązań fosfodiestrowych zlokalizowane w obrębie sekwencji nukleotydowej łańcucha. Miejsca restrykcyjne dla endonukleaz są bardzo zróżnicowane. Niektóre z tych enzymów przecinają DNA (kwas dezoksyrybonukleinowy, nasz materiał genetyczny) prawie wszędzie, to znaczy są niespecyficzne.

W przeciwieństwie do tego istnieje inna grupa endonukleaz, które są bardzo specyficzne w regionie lub sekwencji przeznaczonej do przecięcia. Ta grupa enzymów jest znana jako enzymy restrykcyjne i są bardzo przydatne w biologii molekularnej. W tej grupie mamy dobrze znane enzymy Bam HI, Eco RI i Alu I.

Endonukleazy tną DNA wewnętrznie.
Źródło: pixabay.com

W przeciwieństwie do endonukleaz istnieje inny typ białek katalitycznych - egzonukleazy - które są odpowiedzialne za zrywanie wiązań fosfodiestrowych na końcu łańcucha.

Endonukleazy restrykcyjne

Endonukleazy restrykcyjne lub enzymy restrykcyjne to białka katalityczne odpowiedzialne za rozszczepianie wiązań fosfodiestrowych wewnątrz łańcucha DNA w bardzo specyficznych sekwencjach.

Enzymy te można kupić od wielu firm biotechnologicznych, a ich zastosowanie jest prawie niezbędne w ramach obecnych technik manipulacji DNA.

Endonukleazy restrykcyjne są nazywane przy użyciu pierwszych liter dwumianowej nazwy naukowej organizmu, z którego pochodzą, po których następuje szczep (jest to opcjonalne) i kończy się na grupie enzymów restrykcyjnych, do której należą. Na przykład Bam HI i Eco RI są szeroko stosowanymi endonukleazami.

Region DNA, który rozpoznaje enzym, nazywany jest miejscem restrykcyjnym i jest unikalny dla każdej endonukleazy, chociaż kilka enzymów może pokrywać się w miejscach restrykcyjnych. To miejsce ogólnie składa się z krótkiej sekwencji palindromicznej o długości około 4 do 6 par zasad, takiej jak AGCT (dla Alu I) i GAATTC dla Eco RI.

Sekwencje palindromiczne to sekwencje, które, chociaż czytane w kierunku od 5 'do 3' lub 3 'do 5', są identyczne. Na przykład w przypadku Eco RI sekwencja palindromiczna to: GAATTC i CTTAAG.

Funkcje i zastosowania endonucles restrykcyjnych

Na szczęście dla biologów molekularnych bakterie rozwinęły w toku ewolucji serię endonukleaz restrykcyjnych, które wewnętrznie fragmentują materiał genetyczny.

W naturze enzymy te wyewoluowały - przypuszczalnie - jako system ochrony bakterii przed inwazją obcych cząsteczek DNA, takich jak te z fagów.

W celu rozróżnienia między rodzimym i obcym materiałem genetycznym te endonukleazy restrykcyjne mogą rozpoznawać specyficzne sekwencje nukleotydowe. Zatem DNA, które nie ma tej sekwencji, może pozostać niezakłócone wewnątrz bakterii.

W przeciwieństwie do tego, gdy endonukleaza rozpoznaje miejsce restrykcyjne, wiąże się z DNA i przecina go.

Biolodzy są zainteresowani badaniem materiału genetycznego istot żywych. Jednak DNA składa się z kilku milionów par zasad. Te cząsteczki są niezwykle długie i muszą być analizowane w małych fragmentach.

Aby osiągnąć ten cel, endonukleazy restrykcyjne są włączone do różnych protokołów biologii molekularnej. Na przykład, pojedynczy gen może zostać wychwycony i replikowany do późniejszej analizy. Ten proces nazywa się „klonowaniem” genu.

Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP)

Polimorfizmy długości fragmentów restrykcyjnych odnoszą się do wzoru specyficznych sekwencji nukleotydowych w DNA, które endonukleazy restrykcyjne są w stanie rozpoznać i przeciąć.

Dzięki specyfice enzymów każdy organizm charakteryzuje się określonym wzorem cięcia w DNA, pochodzącym z fragmentów o różnej długości.

Rodzaje endonukleaz restrykcyjnych

Historycznie, endonukleazy restrykcyjne zostały podzielone na trzy typy enzymów, oznaczone cyframi rzymskimi. Ostatnio opisano czwarty typ endonukleazy.

Wpisz I.

Najważniejszą cechą endonukleaz typu I jest to, że są to białka złożone z kilku podjednostek. Każda z tych funkcji działa jako pojedynczy kompleks białkowy i zwykle ma dwie podjednostki zwane R, dwie M i jedną S.

Część S jest odpowiedzialna za rozpoznawanie miejsca restrykcyjnego w DNA. Z kolei podjednostka R jest niezbędna do rozszczepienia, a M jest odpowiedzialna za katalizowanie reakcji metylacji.

Istnieją cztery podkategorie enzymów typu I, znane pod literami A, B, C i D, które są powszechnie używane. Ta klasyfikacja opiera się na komplementacji genetycznej.

Enzymy typu I były pierwszymi endonukleazami restrykcyjnymi, które zostały odkryte i oczyszczone. Jednak najbardziej przydatne w biologii molekularnej są typy II, które zostaną opisane w następnej sekcji.

Typ II

Endonukleazy restrykcyjne typu II rozpoznają specyficzne sekwencje DNA i rozszczepiają w stałej pozycji blisko sekwencji, która wytwarza 5 'fosforany i 3' hydroksy. Zwykle wymagają jonów magnezu (Mg ²⁺ ) jako kofaktorów , ale są takie, które mają znacznie bardziej specyficzne wymagania.

Strukturalnie mogą występować jako monomery, dimery lub nawet tetramery. Technologia rekombinacji wykorzystuje endonukleazy typu II iz tego powodu scharakteryzowano ponad 3500 enzymów.

Typ III

Te układy enzymatyczne składają się z dwóch genów, zwanych mod i res, które kodują podjednostki rozpoznające DNA oraz modyfikacje lub ograniczenia. Obie podjednostki są niezbędne do ograniczenia, procesu całkowicie zależnego od hydrolizy ATP.

Aby rozszczepić cząsteczkę DNA, enzym musi oddziaływać z dwiema kopiami niepalindromicznej sekwencji rozpoznawanej, a miejsca muszą znajdować się w odwrotnej orientacji na substracie. Rozszczepienie poprzedzone jest translokacją DNA.

Typ IV

Ostatnio zidentyfikowano dodatkową grupę. System składa się z dwóch lub więcej genów, które kodują białka, które rozszczepiają tylko zmodyfikowane sekwencje DNA, metylowaną, hydroksymetylowaną lub hydrometylowaną glukozylową.

Na przykład enzym EckKMcrBC rozpoznaje dwa dinukleotydy o ogólnej postaci RmC; puryna, po której następuje metylowana cytozyna, którą można rozdzielić kilkoma parami zasad - od 40 do prawie 3000. Rozszczepienie następuje około 30 par zasad za miejscem rozpoznanym przez enzym.

Endonukleazy typu V.

Endonukleazy tego typu są również znane jako endonukleazy „naprowadzające”. Enzymy te rozpoznają i przecinają docelową sekwencję DNA w unikalnych miejscach w genomie od 14 do 40 pz.

Enzymy te są często kodowane w intronach i uważa się, że ich funkcja polega na promowaniu poziomego przenoszenia przeciętych sekwencji. Po przecięciu następuje naprawa pęknięcia w podwójnej helisie DNA na podstawie sekwencji komplementarnej.

Przykłady

Endonukleaza I z E. coli działa jako system obronny przeciwko fagom i pasożytom. Znajduje się głównie między błoną cytoplazmatyczną a ścianą komórkową. Wytwarza dwuniciowe przerwy w obcym DNA, z którym oddziałuje w przestrzeni peryplazmatycznej.

Endonukleazy CRISPR-Cas to enzymy działające na mechanizm obronny wielu typów bakterii. Identyfikują i wycinają określone sekwencje DNA z atakujących organizmów, którymi są na ogół wirusy.

Niedawno naukowcy z Massachusetts Institute of Technology (MIT) odkryli wysoce precyzyjny system edycji genomu CRISPR-Cas12bm do modyfikacji ludzkich komórek.

Bibliografia

1. Burrell, MM (red.). (1993). Enzymy biologii molekularnej. Totowa, NJ: Humana Press.
2. Loenen, WA, Dryden, DT, Raleigh, EA i Wilson, GG (2013). Enzymy restrykcyjne typu I i ich pokrewne. Badania kwasów nukleinowych, 42 (1), 20-44.
3. Murray, PR, Rosenthal, KS i Pfaller, MA (2017). Mikrobiologia medyczna + StudentConsult w języku hiszpańskim + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
4. Nathans, D. i Smith, HO (1975). Endonukleazy restrykcyjne w analizie i restrukturyzacji cząsteczek DNA. Annual review of biochemistry, 44 (1), 273-293.
5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. i Wende, W. (2005). Endonukleazy restrykcyjne typu II: budowa i mechanizm. Nauki o życiu komórkowym i molekularnym, 62 (6), 685.