ROZMAZ BAKTERYJNY: CHARAKTERYSTYKA I PRZYGOTOWANIE - BIOLOGIA - 2025

Rozmaz bakterii jest cienka warstwa rozmaz zawiesiny mikroorganizmów bakteryjnych, która jest wykonana na przezroczystej płytce szklanej lub slajd, do obserwacji pod mikroskopem świetlnym.

Przedłużenie w postaci filmu przeprowadza się w celu jak największego oddzielenia mikroorganizmów, ponieważ jeśli są zgrupowane, obserwacja nie jest jasna.

Rysunek 1. Rozmaz bakteryjny widoczny pod skaningowym mikroskopem elektronowym. Źródło: pixbay.com

W badaniu kultur bakteryjnych do ich lepszej analizy stosuje się techniki przygotowania rozmazów, utrwalania i barwienia. Ze względu na niewielki rozmiar mikroorganizmów do ich obserwacji koniecznie jest użycie mikroskopu optycznego.

Mikroskopy optyczne są niezbędnymi przyrządami do obserwacji rozmazów. Wykorzystują one soczewki optyczne i światło umożliwiające oglądanie próbek z dużym powiększeniem.

Generalnie, żywe komórki nie mają przeważnie kolorowych struktur, widziane pod mikroskopem świetlnym są bezbarwnymi, przezroczystymi próbkami i wykazują bardzo mały kontrast wewnętrzny i ich otoczenie.

Obserwacja za pomocą prostego mikroskopu świetlnego w polu świetlnym, bez stosowania pomocniczych technik barwienia, jest bardzo ograniczona i jest stosowana tylko w niektórych przypadkach, takich jak obserwacja ruchu mikroorganizmów.

Aby zapewnić optymalną obserwację mikroorganizmów, należy zachować równowagę między kontrastem a rozdzielczością. Szczegółów komórek nie można zobaczyć pod mikroskopem, nawet przy wysokiej rozdzielczości; Stosowanie barwników jest wymagane w przypadku technik barwienia, które zapewniają kontrast do obserwacji.

Charakterystyka dobrej jakości rozmazu bakteryjnego

Doskonały kontrast

Aby uzyskać doskonały kontrast, istnieją wyrafinowane mikroskopy zwane mikroskopami z kontrastem fazowym, mikroskopy interferencyjne różnicowe i mikroskopy pola ciemnego. Ten typ mikroskopu służy m.in. do obserwacji struktur bakteryjnych, takich jak osłony i włókna.

Barwienie to prosta technika zwiększania kontrastu, którą uzyskuje się za pomocą mikroskopu jasnego pola. W tej technice można zastosować różne barwienia, które znacznie poprawiają obserwację mikroskopową.

Plamy są wykonywane bezpośrednio na rozmazach lub przedłużeniach zawiesin mikroorganizmów na szkiełkach, uprzednio wysuszonych i utrwalonych.

Dobra poprawka

Utrwalanie to technika stosowana w celu zachowania struktur komórkowych; powoduje inaktywację mikroorganizmów i przywieranie do szkiełka szkiełka. Istnieją różne sposoby mocowania: utrwalanie na gorąco i utrwalanie chemiczne.

Utrwalanie ciepła

Jest to najczęściej stosowana metoda obserwacji rozmazów bakteryjnych. Technika polega na przepuszczeniu zawiesiny bakteryjnej rozmazu przez płomień zapalniczki. Ta technika jest w stanie zachować zewnętrzną morfologię bakterii, ale niszczy ich wewnętrzne struktury.

Wiązanie chemiczne

Utrwalanie chemiczne wykorzystuje środki konserwujące, takie jak między innymi formaldehyd lub formalina, etanol i kwas octowy. Zaletą stosowania chemicznych środków utrwalających jest to, że uzyskuje się zachowanie wewnętrznej struktury komórkowej mikroorganizmów.

Rysunek 2. Rozmaz krwi. Źródło: Bobjgalindo, źródło Wikimedia Commons

Dobre zabarwienie

Najczęstsze procedury barwienia uprzednio wysuszonego i utrwalonego rozmazu to barwienie pozytywne lub proste, barwienie różnicowe i barwienie negatywne. Istnieją również specjalne techniki barwienia poszczególnych struktur komórkowych (torebka, zarodnik, wici).

Barwienie pozytywne lub proste barwienie

Barwienie pozytywne lub proste jest najczęściej stosowaną techniką barwienia wymazów. Wykorzystuje barwniki, które mają zdolność wiązania się z określonymi strukturami drobnoustrojów, dzięki czemu można je obserwować pod mikroskopem.

Barwniki te mają w swojej strukturze chemicznej grupy chromoforowe (część barwną) z naprzemiennymi wiązaniami podwójnymi i pojedynczymi (koniugacja). Te wiązania mogą z kolei tworzyć wiązania jonowe lub kowalencyjne z niektórymi strukturami komórkowymi.

Barwniki stosowane w barwieniu pozytywowym lub prostym to w większości chemiczne pochodne aniliny (kolorowe sole organiczne).

Z drugiej strony wśród barwników możemy znaleźć niektóre o pH zasadowym, a inne o pH kwaśnym.

Podstawowe barwniki

W podstawowych barwnikach grupa chromoforowa ma dodatni ładunek elektryczny. Zdecydowana większość mikroorganizmów prokariotycznych ma obojętne wewnętrzne pH, a ich powierzchnia komórkowa jest naładowana ujemnie. Dzięki tej interakcji elektrostatycznej chromofor wiąże się z komórką i zabarwia ją.

Przykładami podstawowych barwników są między innymi błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, zieleń malachitowa, podstawowa fuscyna, safranina.

Barwniki kwasowe

W barwnikach kwasowych grupa chromoforowa ma ujemny ładunek elektryczny. Są one używane do barwienia białek z dodatnio naładowanymi grupami aminowymi. Przykładami barwników kwasowych są kwaśna fuscyna, róża bengalska, czerwień Kongo i eozyna.

Barwienie różnicowe

Technika barwienia różnicowego polega na nałożeniu dwóch barwników o różnej barwie lub intensywności w celu rozróżnienia różnych mikroorganizmów pod mikroskopem. Barwienie metodą Grama i barwienie odporne na kwasy i alkohole to najczęściej stosowane barwienia różnicujące w bakteriologii.

Barwienie metodą Grama jest stosowane jako badanie wstępne w celu poznania kształtu, rozmiaru, grupowania komórek, a także rodzaju ściany komórkowej. Za pomocą testu barwienia Grama bakterie ściany komórkowej klasyfikuje się na bakterie Gram dodatnie i bakterie Gram ujemne.

Barwienie negatywne

W tej technice stosuje się barwniki chemiczne, które nie wnikają do wnętrza komórki, ale powodują, że pożywka, w której mikroorganizmy pojawiają się jako czarne tło.

W technice barwienia negatywowego rozmaz wykonywany jest za pomocą kropli tuszu indyjskiego lub zawiesiny nigrozyny, która po wysuszeniu w temperaturze pokojowej tworzy nieprzezroczystą błonę przed przejściem światła. W ten sposób mikroorganizmy pojawiają się jako jasne kształty na ciemnym tle.

Przygotowanie

A. Rozmaz

1.- Umyj szkiełka bardzo dobrze, osusz papierem chłonnym i opisz je. Etykieta musi wskazywać zawartość preparatu, datę i nazwisko osoby, która go przetwarzała.

2.- Zapal zapalniczkę i wysterylizuj pętlę inokulacyjną w płomieniu, aż będzie jaskrawoczerwona.

3.- Poczekaj, aż uchwyt ostygnie.

4.- Weź probówkę do hodowli bakterii, zdejmij nasadkę i szybko przeciągnij wlot probówki w pobliżu płomienia (płomienia) palnika.

5.- Wprowadzić pętlę inokulacyjną do probówki zawierającej kulturę bakteryjną i pobrać próbkę.

6.- Jeśli hodowla jest w płynnej pożywce, umieść próbkę pobraną rączką na środku szkiełka i rozłóż ją ostrożnie w kółko o średnicy około 2 cm.

7.- Ponownie wysterylizuj pętlę inokulacyjną.

8. - Pozostawić rozmaz do wyschnięcia na powietrzu.

9. - Powtórz kroki od 3 do 8 trzy razy.

10.- Jeśli kultura jest na stałym podłożu, wcześniej na szkiełku należy umieścić kroplę wody destylowanej. Odbywa się to w celu zmieszania małej próbki kultury pobranej z pętlą do zaszczepiania, zgodnie z instrukcjami w krokach 2 do 5 (warunki aseptyczne).

11.- Rozprowadzić rozcieńczoną próbkę kroplą wody na szkiełku i powtórzyć trzykrotnie.

B. Utrwalenie

1.- Dodać dwie krople metanolu lub absolutnego etanolu do suchego rozmazu - z kultur na płynnym podłożu -.

2.- Pozwól, aby powietrze wyschło z dala od zapalniczki.

3.- Jeśli rozmaz pochodzi z hodowli na stałym podłożu, suchy rozmaz jest utrwalany ciepłem, przepuszczając go 2 do 3 razy szybko przez najgorętszą część jaśniejszego płomienia.

4.- Dotknij dolnej części wymazu grzbietową częścią lewej ręki (dla osób praworęcznych; w przeciwnym razie użyj prawej ręki) i sprawdź, czy jest zimny.

C. Proste barwienie

1.- Dodać 2 krople wybranej plamy do rozmazu i pozostawić na czas wymagany w określonych protokołach dla każdej plamy (zwykle od 1 do 5 minut).

2.- Niektóre plamy wymagają użycia ciepła do ich aktywacji, w takim przypadku należy zachować szczególną ostrożność podczas podgrzewania szkiełka w jaśniejszym płomieniu (manipulować szczypcami i unikać wrzenia). Przegrzanie rozmazu może zniszczyć obserwowane komórki.

3.- Usuń nadmiar barwnika przemywając go wodą destylowaną z piketki. Usunąć wodę myjącą delikatnie stukając szkiełkiem w jego krawędź, przechyloną na stole roboczym.

4. - Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.

5.- W zależności od rodzaju obserwacji na tym etapie stosuje się szkiełko nakrywkowe lub nie. Szkiełko nakrywkowe chroni i konserwuje rozmaz. Jeśli na tym etapie wykonuje się obserwację immersji w olejku, nie używa się szkiełek nakrywkowych, ale rozmaz nie może zostać zachowany.

D. Ostateczne zachowanie rozmazu

1. - Zanurz rozmaz kolejno w każdym z roztworów wskazanych poniżej na minimum 5 minut. Celem tych „kąpieli” jest całkowite odwodnienie rozmazu. Każdy odczynnik należy dokładnie osuszyć przed wprowadzeniem rozmazu do kolejnej kąpieli.

Kolejność kąpieli odwadniających jest następująca:

1. Etanol 70%
2. Etanol 95%
3. Czysty aceton
4. Mieszanina aceton-ksylol 1: 1
5. Xylol

Następnie pozostaw do wyschnięcia.

2.- Zamocować szkiełko nakrywkowe, najlepiej 22 × 22 mm, używając balsamu kanadyjskiego lub innego środka mocującego.

Bibliografia

1. Briggs, G. (1965). Przyczyny wypadków i zakażeń w laboratoriach mikrobiologicznych. Laboratoria biologiczne armii amerykańskiej. Fort Detrick.
2. Cappucino, JG and Welch, CT (2017). Mikrobiologia: podręcznik laboratoryjny. Osoba.
3. Holt, redaktor JG. (1977). Krótszy podręcznik Bergeya's Manual of Determinative Bacteriology. 8 ^th Baltimore: The Williams and Wilkins Co.
4. Johnson, TR i Case; CL (2018). Eksperymenty laboratoryjne w mikrobiologii. Osoba.
5. Tille, P. (2017). Mikrobiologia diagnostyczna. 14 ^th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.