HISTOCHEMIA: UZASADNIENIE, PRZETWARZANIE, BARWIENIE - BIOLOGIA - 2026

Histochemiczne jest użytecznym narzędziem do badania morfologii różnych tkanek biologicznych (rośliny i zwierzęta), ze względu na zasady reakcji składników tkanek, takich jak węglowodany, tłuszcze i białka, między innymi barwniki chemicznych.

To cenne narzędzie pozwala nie tylko zidentyfikować skład i strukturę tkanek i komórek, ale także różne reakcje, które w nich zachodzą. Można również wykazać możliwe uszkodzenie tkanki spowodowane obecnością mikroorganizmów lub innymi patologiami.

Plamy histochemiczne. Wirus Nilu, Bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne (Gram), Histoplasma capsulatum (Grocott), Mycobacterium tuberculosis (Ziehl Neelsen). Źródło: Pixinio.com/Wikipedia.org/Nephron / CDC / Dr. George P. Kubica

Histochemia z minionych stuleci wniosła ważny wkład, na przykład wykazanie istnienia bariery krew-mózg przez Paula Ehrlicha. Było to możliwe, ponieważ mózg zwierzęcia doświadczalnego użytego przez Ehrlicha nie był zabarwiony aniliną, która jest podstawowym barwnikiem.

Doprowadziło to do zastosowania różnych barwników, takich jak błękit metylenowy i indofenol, do barwienia różnych typów komórek. To odkrycie doprowadziło do klasyfikacji komórek na kwasofilne, zasadofilne i neutrofilne, zgodnie z ich specyficznym barwieniem.

Niedawne badania wykorzystały tę technikę do wykazania obecności różnych związków, w tym fenoli, a także węglowodanów i niestrukturalnych lipidów, w tkankach gatunku Litsea glaucescens, lepiej znanego jako laur. Znajdowanie ich, zarówno w liściu, jak iw drewnie.

Podobnie Colares i in., 2016, zidentyfikowali roślinę o znaczeniu medycznym Tarenaya hassleriana, używając technik histochemicznych. U tego gatunku stwierdzono obecność skrobi, myrozyny oraz związków fenolowych i lipofilowych.

Podstawa

Histochemia polega na barwieniu struktur komórkowych lub molekuł obecnych w tkankach, dzięki ich powinowactwu do określonych barwników. Reakcja zabarwienia tych struktur lub cząsteczek w ich pierwotnym formacie jest później wizualizowana w mikroskopie optycznym lub mikroskopie elektronowym.

Specyfika barwienia wynika z obecności grup akceptujących jony obecnych w komórkach lub cząsteczkach tkanek.

Wreszcie, celem reakcji histochemicznych jest możliwość pokazania tego poprzez barwienie. Od największych struktur biologicznych po najmniejsze tkanki i komórki. Można to osiągnąć dzięki temu, że barwniki reagują chemicznie z cząsteczkami tkanek, komórek czy organelli.

Oskarżenie

Reakcja histochemiczna może obejmować etapy poprzedzające wykonanie techniki, takie jak utrwalenie, osadzenie i przecięcie tkanki. Dlatego należy wziąć pod uwagę, że na tych etapach identyfikowana struktura może zostać uszkodzona, dając wyniki fałszywie ujemne, nawet jeśli występuje.

Mimo to wcześniejsze utrwalenie tkanki wykonane prawidłowo jest ważne, gdyż zapobiega autolizie czy zniszczeniu komórek. W tym celu stosuje się reakcje chemiczne z rozpuszczalnikami organicznymi, takimi jak między innymi: formaldehyd czy glutaraldehyd.

Włączenie tkaniny odbywa się w taki sposób, aby zachowało swoją jędrność podczas cięcia, a tym samym zapobiegało odkształcaniu się. Na koniec nacięcie wykonuje się za pomocą mikrotomu do badania próbek pod mikroskopem optycznym.

Dodatkowo, przed przystąpieniem do barwienia histochemicznego, zaleca się włączenie zewnętrznej lub wewnętrznej kontroli pozytywnej do każdej serii testów. Jak również użycie specjalnych barwników do badanych struktur.

Plamy histochemiczne

Od pojawienia się technik histochemicznych do chwili obecnej stosowano szeroką gamę barwników, w tym najczęściej stosowane, takie jak: Periodic acid Schiff (PAS), Grocott, Ziehl-Neelsen i Gram.

Podobnie, inne barwniki były używane rzadziej, takie jak między innymi tusz indyjski, orceina lub trichromowa plama Massona.

Periodic Acid Schiff (PAS)

Przy takim zabarwieniu można zaobserwować cząsteczki o dużej zawartości węglowodanów, takie jak: glikogen i mucyna. Jednak jest również przydatna do identyfikacji mikroorganizmów, takich jak grzyby i pasożyty. Oprócz niektórych struktur (błona podstawna) w skórze i innych tkankach.

Podstawą tego barwienia jest to, że barwnik utlenia wiązania węglowe między dwiema pobliskimi grupami hydroksylowymi. Powoduje to uwolnienie grupy aldehydowej, co jest wykrywane przez odczynnik Schiffa, wydzielając purpurowy kolor.

Odczynnik Schiffa składa się z zasadowej fuksyny, pirosiarczynu sodu i kwasu solnego, które są odpowiedzialne za fioletowe zabarwienie, gdy obecne są grupy aldehydowe. W przeciwnym razie powstaje bezbarwny kwas.

Intensywność zabarwienia zależy od ilości grup hydroksylowych obecnych w monosacharydach. Na przykład w przypadku grzybów, błon podstawnych, mucyn i glikogenu kolor może wahać się od czerwonego do fioletowego, podczas gdy jądra zabarwiają się na niebiesko.

Grocott

Jest to jedna z barw o najwyższej czułości w identyfikacji grzybów w tkankach zatopionych w parafinie. Pozwala to na identyfikację różnych struktur grzybów: między innymi strzępek, zarodników, przetrwalników. Dlatego jest uważana za rutynową plamę w diagnostyce grzybicy.

Jest szczególnie stosowany w diagnostyce grzybic płuc, takich jak pneumocystoza i aspergiloza, wywoływanych przez niektóre grzyby odpowiednio z rodzaju Pneumocystis i Aspergillus.

Roztwór ten zawiera azotan srebra i kwas chromowy, który jest utrwalaczem i barwnikiem. Uzasadnieniem jest to, że kwas ten powoduje utlenianie grup hydroksylowych do aldehydów przez mukopoliesacharydy obecne w strukturach grzybów, na przykład w ścianie komórkowej grzybów.

Wreszcie srebro obecne w roztworze jest utleniane przez aldehydy, powodując czarne zabarwienie, które nazywa się reakcją argentafiny. Można również stosować kontrastowe barwniki, takie jak jasnozielony, dzięki czemu struktury grzybów będą widoczne w kolorze czarnym na jasnozielonym tle.

Ziehl-Neelsen

Zabarwienie to opiera się na obecności częściowej lub całkowitej odporności na kwasy i alkohole niektórych mikroorganizmów, takich jak z rodzaju Nocardia, Legionella i Mycobacterium.

Zaleca się stosowanie tego barwnika, ponieważ ściana komórkowa wspomnianych mikroorganizmów zawiera złożone lipidy, które utrudniają penetrację barwników. Szczególnie w próbkach z dróg oddechowych.

Stosuje się w nim mocne barwniki, takie jak fuksyna karbolowa (barwnik podstawowy) i poddaje się działaniu ciepła tak, aby mikroorganizm mógł zatrzymać barwnik i nie odbarwił się pod wpływem kwasów i alkoholi. Na koniec, do zabarwienia struktur, które odbarwiły się, nakłada się roztwór błękitu metylenowego.

Obecność odporności na kwasy i alkohole obserwuje się w strukturach zabarwionych na czerwono, podczas gdy struktury, które nie są odporne na blaknięcie, są zabarwione na niebiesko.

Atrament gramowy i chiński

Grama jest bardzo przydatną barwnikiem m.in. w diagnostyce infekcji bakteryjnych i grzybiczych. Barwienie to umożliwia rozróżnienie drobnoustrojów Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, wyraźnie pokazując różnice, jakie istnieją w składzie ściany komórkowej.

Podczas gdy tusz indyjski jest plamą używaną do kontrastowania struktur zawierających polisacharydy (kapsułka). Dzieje się tak, ponieważ w środowisku tworzy się pierścień, który jest możliwy u Cryptococcus neoformans.

Orcein

Przy takim barwieniu elastyczne włókna i chromosomy różnych komórek są zabarwione, co pozwala na ocenę procesu ich dojrzewania. Z tego powodu okazał się bardzo przydatny w badaniach cytogenetycznych.

Opiera się to na wychwytywaniu barwnika przez ujemny ładunek cząsteczek, takich jak DNA, obecnych w jądrach wielu różnych komórek. Więc są zabarwione na niebiesko do ciemnofioletowego.

Trichrom Massona

Ta plama służy do identyfikacji niektórych mikroorganizmów lub materiałów zawierających pigmenty melaniczne. Tak jest w przypadku grzybic, wywoływanych przez grzyby dematiaceous, pheohifomycosis oraz u czarnoziarnistego.

Końcowe przemyślenia

W ostatnich latach poczyniono wiele postępów w tworzeniu nowych technik diagnostycznych, w które zaangażowana jest histochemia, ale jest połączona z innymi podstawami lub zasadami. Techniki te mają inne przeznaczenie, jak w przypadku immunohistochemii czy enzymohistochemii.

Bibliografia

1. Acuña U, Elguero J. Histoquímica. An. Chem. 2012; 108 (2): 114-118. Dostępne pod adresem: are.iqm.csic.es
2. Mestanza R. Częstotliwość wykonywania barwień histochemicznych PAS, Grocott i Ziehl-Neelsen stosowanych do identyfikacji mikroorganizmów, wykonanych w Oddziale Anatomii Patologicznej Szpitala Specjalistycznego im. Eugenio Espejo w 2015 r. Centralny Uniwersytet Ekwadoru, Quito; Dostępne pod adresem: dspace.uce.edu
3. Tapia-Torres N, de la Paz-Pérez-Olvera C, Román-Guerrero A, Quintanar-Isaías A, García-Márquez E, Cruz-Sosa F. Histochemia, całkowita zawartość fenolu i aktywność przeciwutleniająca liści i drewna litsea glaucescens Kunth (Lauraceae). Drewno i lasy. 2014; 20 (3): 125-137. Dostępne pod adresem: redalyc.org
4. Colares, MN, Martínez-Alonso, S, Arambarri, AM. Anatomia i histochemia Tarenaya hassleriana (Cleomaceae), gatunku o znaczeniu medycznym. Biuletyn Roślin Leczniczych i Aromatycznych Ameryki Łacińskiej i Karaibów 2016; 15 (3): 182-191. Dostępne pod adresem: redalyc.org
5. Bonifaz A.Podstawy mikologii lekarskiej. Wydanie 4. Meksyk: redakcja McGraw-Hill Interamericana, SA de CV 2012.
6. Silva Diego Filipe Bezerra, Santos Hellen Bandeira de Pontes, León Jorge Esquiche, Gomes Daliana Queiroga de Castro, Alves Pollianna Muniz, Nonaka Cassiano Francisco Weege. Analiza kliniczna patologiczna i immunohistochemiczna raka kolczystokomórkowego języka wrzecionowokomórkowego: rzadki przypadek. Einstein (São Paulo) 2019; 17 (1): eRC4610. Dostępne pod adresem: scielo.br