IMMUNOFLUORESCENCJA: UZASADNIENIE, PROTOKÓŁ I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Immunofluorescencji jest silnym technika z zastosowaniem immunofluorescencji, stosując przeciwciała, kowalencyjnie przyłączone do cząsteczki fluorescencyjne w celu identyfikacji konkretnych celów w próbkach komórek na stałym podłożu stałym.

Technika ta obejmuje obserwację mikroskopową ze swoistością immunologiczną, umożliwiającą obserwację żywych lub martwych komórek, które mogą prezentować niewielkie ilości antygenów. Znajduje szerokie zastosowanie zarówno w badaniach naukowych, jak iw diagnostyce klinicznej różnych patologii.

Immunologicznie znakowanie filamentów aktyny w komórkach kardiomiocytów (źródło: Ps1415 za Wikimedia Commons)

Technika ta, głównie jakościowa (z pewnymi wariantami ilościowymi), ma szczególny związek z wizualizacją próbki przez sygnał iloczynu fluoroforu, który jest cząsteczką fluorescencyjną związaną z przeciwciałem i która może być wzbudzana na określonej długości fali .

W kontekście komórkowym bardzo przydatne jest badanie obecności / braku i subkomórkowej lokalizacji białek. Technika ta była początkowo stosowana w warunkach klinicznych do diagnostyki wirusów, takich jak grypa, a następnie wielu innych chorób zakaźnych.

Jest to bardzo czuła technika, a przy odpowiednim wyposażeniu mikroskopowym może mieć bardzo dobrą rozdzielczość. Wymaga do obserwacji użycia mikroskopów konfokalnych lub epifluorescencyjnych.

Jednak pomimo tego, że jest bardzo popularny, może stwarzać pewne istotne problemy związane z uzyskaniem nieswoistej fluorescencji, która generuje pewien „szum” tła, co często ogranicza prawidłowy odczyt wyników.

Podstawa

Immunofluorescencja opiera się na wykorzystaniu biologicznego zjawiska reakcji interakcji między przeciwciałem a antygenem. Ma to konkretny związek z wizualizacją lub wykrywaniem tej reakcji przez wzbudzanie cząsteczek fluorescencyjnych o określonej długości fali.

Przeciwciało to białko immunoglobuliny wydzielane przez aktywne komórki B, które jest specyficznie generowane przeciwko antygenowi, z którym może wiązać się z dużym powinowactwem i swoistością. Immunofluorescencja wykorzystuje immunoglobuliny IgG, które są rozpuszczalne w surowicy krwi.

Przeciwciała to cząsteczki o masie do 950 kDa zbudowane z dwóch krótkich (lekkich) i dwóch długich łańcuchów peptydowych w kształcie litery „Y” (ciężkich). Zarówno łańcuch lekki, jak i ciężki są podzielone na dwie domeny: jedną zmienną, zdolną do rozpoznawania antygenu, oraz drugą stałą lub konserwatywną, charakterystyczną dla każdego gatunku.

Antygeny są zdefiniowane funkcjonalnie jako cząsteczki, które mogą być rozpoznawane przez przeciwciało i są w większości białkami. Kiedy zwierzę jest narażone na działanie antygenu, aktywują się limfocyty układu odpornościowego, wytwarzając specyficzne przeciwciała, które działają jako system obronny.

Na przykład antygen, taki jak białko, może mieć więcej niż jeden epitop lub miejsce rozpoznawane przez przeciwciało, a zatem surowica zwierzęcia eksponowanego na antygen może mieć przeciwciała poliklonalne przeciwko różnym regionom tego samego białka.

Immunofluorescencja wykorzystuje zatem zdolność zwierzęcia do wytwarzania przeciwciał poliklonalnych skierowanych przeciwko określonemu antygenowi w celu jego oczyszczenia, a następnie wykorzystania go do wykrycia tego samego antygenu w innych kontekstach.

Wśród barwników lub cząsteczek fluorescencyjnych najczęściej stosowanych w niektórych technikach immunofluorescencji są izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), izotiocyjanian tetrametylorodaminy-5 i 6 (TRITC), wiele cyjanin, takich jak Cy2, Cy3, Cy5 i Cy7 oraz barwniki zwane Alexa Fluor® , na przykład Alexa Fluor®448.

Protokół

Protokół immunofluorescencji różni się w zależności od wielu czynników, jednak ogólnie rzecz biorąc obejmuje liniową sekwencję etapów składającą się z:

• Przygotowanie płytek i komórek
• Utrwalanie próbek
• Permeabilizacja
• Bloking
• Barwienie immunologiczne lub barwienie immunologiczne
• Montaż i obserwacja

-Przygotowanie

Próbek

Przygotowanie próbek będzie zależało od ich charakteru i rodzaju doświadczenia, które ma zostać przeprowadzone. Najprostszy przypadek, który obejmuje użycie komórek w zawiesinie, zostanie wyjaśniony poniżej.

Komórki w zawiesinie, to znaczy w płynnej pożywce hodowlanej, należy najpierw oddzielić od niej przez wirowanie, a następnie przemyć roztworem buforowym lub izosmotycznym „buforem”, który zachowuje ich integralność.

Zwykle stosuje się bufor fosforanowo-solankowy znany jako PBS, w którym komórki są ponownie zawieszane i ta mieszanina jest ponownie wirowana w celu uzyskania komórek wolnych od pożywki hodowlanej, która może zawierać substancje przeszkadzające.

Ostrzy

Szkiełka używane do obserwacji mikroskopowych, na których komórki zostaną później utrwalone do odpowiednich dalszych zabiegów, również muszą być starannie przygotowane.

Są one pokryte lub „uczulone” roztworem poli-lizyny, syntetycznego polimeru, który będzie działał jako „klej molekularny” między komórkami a stałym podłożem, dzięki elektrostatycznemu oddziaływaniu między dodatnimi ładunkami ich grup aminowych a ładunki ujemne na białkach pokrywających komórki.

Utrwalanie próbek

Proces ten polega na unieruchomieniu białek znajdujących się wewnątrz komórki w celu zachowania ich przestrzennego położenia. Zastosowane cząsteczki muszą być zdolne do przekraczania wszystkich typów błon komórkowych i tworzenia sieci z białkami kowalencyjnymi.

Szeroko stosuje się formaldehyd i paraformaldehyd, glutaraldehyd, a nawet metanol, z którymi próbki komórek inkubuje się przez określony czas, a następnie przemywa izosmotycznym roztworem buforowym.

Po zamocowaniu komórek nadal są one przyczepiane do arkuszy uprzednio uczulonych polilizyną.

Permeabilizacja

W zależności od rodzaju przeprowadzanego testu konieczna będzie permeabilizacja badanych komórek lub nie. Jeśli poszukiwana jest znajomość lokalizacji, obecności lub braku określonego białka na powierzchni komórki, permeabilizacja nie będzie konieczna.

Z drugiej strony, jeśli chcesz poznać lokalizację białka wewnątrz komórki, niezbędna jest permeabilizacja i będzie polegać na inkubacji próbek z Triton X-100, detergentem zdolnym do przepuszczania błon komórkowych.

Bloking

Podstawowym krokiem we wszystkich technikach immunologicznych jest blokowanie. Na tym etapie procedury blokowanie polega na pokryciu na uczulonych arkuszach wszystkich miejsc molekułami poli-lizyny, do których komórki nie przylegały. Oznacza to, że zapobiega jakiemukolwiek niespecyficznemu związkowi.

Zwykle do blokowania stosuje się roztwory z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w buforze PBS, a najlepsze wyniki uzyskuje się im dłuższy czas inkubacji z tym roztworem. Po każdym kroku, w tym blokowaniu, należy zmyć pozostały roztwór.

Barwienie immunologiczne lub barwienie immunologiczne

Procedura barwienia immunologicznego lub barwienia immunologicznego będzie zależeć głównie od tego, czy jest to immunofluorescencja bezpośrednia, czy pośrednia (patrz poniżej).

Jeśli jest to immunofluorescencja pierwotna lub bezpośrednia, próbki będą inkubowane z pożądanymi przeciwciałami, które muszą być sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi. Procedura inkubacji polega na wykonaniu rozcieńczenia przeciwciała w roztworze, który również będzie zawierał BSA, ale w mniejszej proporcji.

W przypadku wtórnej lub pośredniej immunofluorescencji należy przeprowadzić dwie kolejne inkubacje. Najpierw z pożądanymi przeciwciałami, a następnie z przeciwciałami, które są zdolne do wykrywania stałych regionów pierwotnych immunoglobulin. To właśnie te drugorzędowe przeciwciała są kowalencyjnie związane z fluoroforami.

Technika ta jest bardzo wszechstronna, umożliwiając jednoczesne znakowanie więcej niż jednego antygenu na próbkę, o ile istnieją przeciwciała pierwotne sprzężone z różnymi fluoroforami, w przypadku bezpośredniej immunofluorescencji.

W celu jednoczesnego znakowania w immunofluorescencji pośredniej konieczne jest zapewnienie, że każde przeciwciało pierwszorzędowe jest produkowane u innego zwierzęcia, a także że każde przeciwciało drugorzędowe jest sprzężone z innym fluoroforem.

Podobnie jak w przypadku blokowania, inkubacja z przeciwciałami daje lepsze wyniki, im dłużej to trwa. Po każdym etapie należy zmyć nadmiar przeciwciał, które nie związały się z próbkami, aw immunofluorescencji wtórnej należy zablokować przed dodaniem przeciwciała drugorzędowego.

Niektóre techniki wykorzystują inne barwienia, które nie są związane z barwieniem immunologicznym, takie jak barwienie jądrowego DNA za pomocą fluoroforu DAPI.

Montaż i obserwacja

Podczas ostatniego czasu inkubacji z fluoroforami konieczne jest, aby próbki pozostawały w ciemności. Do obserwacji pod mikroskopem często używa się pewnych substancji, aby zachować fluorescencję fluoroforów sprzężonych z przeciwciałami.

Rodzaje

Graficzne podsumowanie immunofluorescencji bezpośredniej i pośredniej (źródło: Westhayl618 za pośrednictwem Wikimedia Commons)

Immunofluorescencja bezpośrednia lub pierwotna

Ma to związek z wykrywaniem antygenów za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych. Główną zaletą stosowania tej techniki jest jej szybkość, jednak w procesie może wystąpić wiele przypadków niespecyficznego wiązania, szczególnie podczas badania surowic ludzkich, ponieważ są one bogate w wysoce heterogenne przeciwciała.

Immunofluorescencja pośrednia lub wtórna

Znana jest również jako technika „kanapkowa” i obejmuje ona rozwój techniki w dwóch etapach. Pierwsza dotyczy użycia niefluorescencyjnego przeciwciała i jego wiązania z interesującym nas antygenem.

Przeciwko regionowi stałemu tego pierwszego przeciwciała (który będzie teraz służył jako antygen) stosuje się drugie przeciwciało zdolne do jego rozpoznawania, które jest związane z cząsteczką fluorescencyjną.

Pojawienie się sygnału fluorescencyjnego będzie wynikiem specyficznego rozpoznawania między pierwszym niefluorescencyjnym przeciwciałem i antygenem będącym przedmiotem zainteresowania; obecność tego pierwszego przeciwciała warunkuje obecność drugiego, które jest wyznakowane i dzięki czemu można określić obecność lub brak antygenu.

Pomimo tego, że jest to technika znacznie bardziej czasochłonna niż bezpośrednia immunofluorescencja (ponieważ obejmuje jeszcze jeden etap inkubacji), technika ta nie obejmuje projektowania przeciwciała fluorescencyjnego dla każdego badanego antygenu, co skutkuje ekonomicznie bardziej opłacalne.

Ponadto jest to bardziej czuła technika pod względem wzmacniania sygnału, ponieważ więcej niż jedno przeciwciało drugorzędowe może wiązać się ze stałym regionem przeciwciała pierwotnego, wzmacniając w ten sposób intensywność sygnału fluorescencyjnego.

Aplikacje

Jak można było wcześniej zauważyć, immunofluorescencja jest niezwykle wszechstronną techniką, która jest wykorzystywana na wiele sposobów w nauce i klinice. Może służyć do odpowiedzi na pytania ekologiczne, genetyczne i fizjologiczne dotyczące wielu organizmów.

Wśród zastosowań klinicznych służy do bezpośredniej diagnostyki niektórych chorób dermatologicznych, przy użyciu bezpośredniej lub pośredniej immunofluorescencji na tkance nabłonkowej badanych pacjentów.

Techniki immunofluorescencji są dostępne w organizmach jednokomórkowych, takich jak drożdże, do wizualizacji mikrotubul wewnątrzjądrowych i cytoplazmatycznych, aktyny i powiązanych białek, włókien 10 nm i innych składników cytoplazmy, błony i ścian komórkowych.

Bibliografia

1. Abcam, immunocytochemia i protokół immunofluorescencji. Pobrane z abcam.com
2. Greph, C. (2012). Barwniki fluorescencyjne. Pobrane z leica-microsystems.com
3. Miller, DM i Shakest, DC (1995). Mikroskopia immunofluorescencyjna. In Methods in Cell Biology (Vol. 48, str. 365–394). Academic Press, Inc.
4. Odell, ID, & Cook, D. (2013). Techniki immunofluorescencji. Journal of Investigative Dermatology, 133, 1–4.
5. Princle, BJR, Adams, AEM, Druain, DG, & Brian, K. (1991). Metody immunofluorescencyjne dla drożdży. In Methods of Enzymology (tom 194, str. 565–602). Academic Press, Inc.
6. Schaeffer, M., Orsi, E. V i Widelock, D. (1964). Zastosowania immunofluorescencji w wirusologii zdrowia publicznego. Bacteriological Reviews, 28 (4), 402–408.
7. Vrieling, EG i Anderson, DM (1996). Immunofluorescencja w badaniach fitoplanktonu: zastosowania i potencjał. J: Phycol. , 32, 1–16.