MEDIO: UZASADNIENIE, PRZYGOTOWANIE, ZASTOSOWANIA I OGRANICZENIA - BIOLOGIA - 2025

Podłoże do fermentacji OF lub glukozy jest półstałym agarem zaprojektowanym specjalnie do badania metabolizmu oksydacyjnego i fermentacyjnego węglowodanów ważnej grupy mikroorganizmów innych niż Enterobacteriaceae, zwanych niejelitowymi pałeczkami Gram-ujemnymi.

Został stworzony przez Hugh i Leifson; badacze ci zdali sobie sprawę, że konwencjonalne metody badania produkcji kwasu z węglowodanów nie są odpowiednie dla tej konkretnej grupy bakterii.

A. Handlowa podstawa pożywki. B. Probówki z średnio wysianymi roślinami. Źródło: A i B Zdjęcia autorstwa mgr inż. Marielsa Gil.

Dzieje się tak, ponieważ niejelitowe pałeczki Gram-ujemne generalnie wytwarzają niewielkie ilości kwasów, w przeciwieństwie do Enterobacteriaceae.

W tym sensie pożywka OF ma specjalne właściwości, które pozwalają wykryć niewielkie ilości powstającego kwasu, zarówno na drodze utleniania, jak i fermentacji. Różnice te są związane z ilością peptonów, węglowodanów i agaru.

Pożywka ta zawiera mniej peptonów i większe stężenie węglowodanów, redukując w ten sposób produkty alkalizujące pożywkę w wyniku metabolizmu białek i zwiększając produkcję kwasów w wyniku zastosowania węglowodanów.

Z drugiej strony, zmniejszenie ilości agaru sprzyja rozprzestrzenianiu się kwasu wytwarzanego w pożywce, a także pozwala obserwować ruchliwość.

Pożywka OF składa się z peptonu, chlorku sodu, błękitu bromotymolowego, fosforanu dipotasowego, agaru i węglowodanu. Najpopularniejszym węglowodanem jest glukoza, ale można użyć innych, według których chce się badać, takich jak między innymi laktoza, maltoza, ksyloza.

Podstawa

Jak każda pożywka hodowlana, pożywka OF musi zawierać substancje odżywcze gwarantujące rozwój bakterii; te substancje to peptony.

Węglowodan ze swojej strony dostarcza energii i jednocześnie służy do badania zachowania się drobnoustroju wobec niego, to znaczy pozwala zaklasyfikować bakterie jako organizm utleniający, fermentujący lub niesacharolityczny.

Podłoże OF zawiera 1: 5 pepton / węglowodany w przeciwieństwie do konwencjonalnych podłoży 2: 1. Dzięki temu ilość amin alkalicznych powstających w wyniku degradacji peptonów nie neutralizuje powstawania słabych kwasów.

Z drugiej strony podłoże zawiera chlorek sodu i fosforan dipotasowy. Związki te stabilizują osmotycznie pożywkę i odpowiednio regulują pH. Błękit bromotymolowy jest wskaźnikiem pH, który zmienia kolor pożywki z zielonego na żółty w wyniku produkcji kwasu.

Niektóre mikroorganizmy mogą wykorzystywać węglowodany na drodze utleniania lub fermentacji, podczas gdy inne nie korzystają z żadnej z tych dróg.

Zależy to od cech każdego mikroorganizmu. Na przykład niektóre ściśle tlenowe mikroorganizmy mogą utleniać niektóre węglowodany, a fakultatywne beztlenowce mogą utleniać i fermentować w zależności od otaczającego ich środowiska, podczas gdy inne nie utleniają ani nie fermentują węglowodanów (asakarolityczne).

Wreszcie, istnieje modyfikacja pożywki OF zalecana przez CDC, która zawiera specjalną bazę OF z czerwienią fenolową jako wskaźnikiem.

Proces utleniania

Proces utleniania glukozy nie wymaga fosforylacji glukozy, podobnie jak proces fermentacji. W tym przypadku grupa aldehydowa jest utleniana do grupy karboksylowej, w wyniku czego powstaje kwas glukonowy. Ten z kolei jest utleniany do 2-ketoglukonu.

Ten ostatni albo gromadzi się, albo rozkłada na dwie cząsteczki kwasu pirogronowego. Ten system wymaga obecności tlenu lub jakiegoś związku nieorganicznego jako końcowego akceptora elektronów.

Produkcja kwasów tą drogą jest słabsza niż ta otrzymywana drogą fermentacji.

Proces fermentacji

Aby fermentacja glukozy przebiegała dowolną z dostępnych dróg, musi najpierw zostać fosforylowana, stając się glukozo-6-fosforanem.

Fermentacja glukozy może przebiegać kilkoma drogami, z których główna to trasa Embden-Meyerhof-Parnas, ale mogą również odbywać się drogą Entner-Doudoroff lub drogą monofosforanu heksozy Warburga-Dickensa, znaną również jako degradacji pentoz.

Wybrana droga będzie zależała od systemu enzymatycznego, który posiada mikroorganizm.

Via Embden-Meyerhof- Parnas

Podczas fermentacji glukozy na drodze Embden-Meyerhof-Parnas jest ona rozszczepiana na dwie cząsteczki triozy, które później ulegają degradacji do różnych związków węgla, aż do powstania gliceraldehydo-3-fosforanu. Stamtąd pochodzi substancja pośrednia, którą jest kwas pirogronowy.

Stamtąd będą powstawały różne rodzaje mieszanych kwasów, które mogą się różnić w zależności od gatunku.

Ten system występuje przy braku tlenu i wymaga związku organicznego jako ostatecznego akceptora elektronów.

Szlak Entner-Doudoroff

Podczas fermentacji glukozy na szlaku Entner-Doudoroff, 6-fosforan glukozy staje się glukono-ᵼ-laktono-6-fosforanem i stamtąd jest utleniany do 6-fosfoglukonianu i 2-keto-3-deoksy-6- fosfoglukonian, aby ostatecznie utworzyć kwas pirogronowy. Ten szlak wymaga tlenu do wystąpienia glikolizy.

Szlak degradacji pentoz lub szlak monofosforanu Warburg-Dickens Hexoxa

Ta trasa jest hybrydą dwóch powyższych. Zaczyna się podobnie do szlaku Entner-Doudoroff, ale później tworzy się gliceraldehyd-3-fosforan jako prekursor kwasu pirogronowego, jak to ma miejsce w szlaku Embden-Meyerhof-Parnas.

Przygotowanie

Ważyć:

2 g peptonu

5 g chlorku sodu

10 g D-glukozy (lub węglowodanu do przygotowania)

0,03 g błękitu bromotymolowego

3 gr agaru

0,30 g fosforanu dipotasowego

1 litr wody destylowanej.

Wymieszaj wszystkie związki z wyjątkiem węglowodanów i rozpuść w 1 litrze wody destylowanej. Podgrzej i wstrząśnij do całkowitego rozpuszczenia.

Po schłodzeniu do 50 ° C dodaje się 100 ml 10% glukozy (przefiltrowanej).

W warunkach aseptycznych rozprowadź 5 ml pożywki OF do probówek z bawełnianą nakrętką i autoklawuj w 121 ° C, pod ciśnieniem 15 funtów przez 15 minut.

Pozostawić do zestalenia w pozycji pionowej.

Pożywka powinna mieć pH 7,1, a przygotowana pożywka ma kolor zielony.

Przechowywać w lodówce.

Aplikacje

Pożywka OF jest specjalną pożywką do określania zachowania metabolicznego mikroorganizmu w stosunku do węglowodanów. Szczególnie dla tych, które tworzą mało, słabo lub wcale kwasów.

Posiany

Dla każdego mikroorganizmu potrzebne są 2 probówki OF, obie muszą być zaszczepione badanym mikroorganizmem. Kolonię pobiera się prostym uchwytem i nakłuwa w środku probówki bez sięgania do dna; Można wykonać kilka nakłuć, o ile obserwacja ruchliwości nie jest interesująca.

Warstwę sterylnej płynnej wazeliny lub jałowej stopionej parafiny (około 1 do 2 ml) dodaje się do jednej z probówek i oznakowuje literą „F”. Druga probówka pozostaje oryginalna i jest oznaczona „O”. Obie probówki inkubuje się w 35 ° C i codziennie obserwuje przez okres do 3 do 4 dni.

Interpretacja

Metabolizm i produkcja gazów

Tabela: Klasyfikacja mikroorganizmów ze względu na ich zachowanie w otwartych (utleniających) i zamkniętych (fermentacyjnych) probówkach OF

Źródło: Opracował mgr inż. Marielsa gil

Gaz jest obserwowany z tworzeniem się pęcherzyków lub przemieszczaniem agaru.

Należy zaznaczyć, że organizm, który tylko utlenia glukozę, ale jej nie fermentuje, nie będzie w stanie fermentować innych węglowodanów, w każdym razie tylko ją utlenia. Dlatego w tej sytuacji szczelna probówka do badania innych węglowodanów zostanie pominięta.

Poruszanie się

Dodatkowo ruchliwość można zobaczyć w medium OF.

Ruchliwość dodatnia : wzrost, który nie ogranicza się do obszaru zaszczepienia. Występuje wzrost w kierunku boków rurki.

Ruchliwość ujemna : wzrost tylko w początkowym inokulum.

QA

Do kontroli jakości można wykorzystać następujące szczepy: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa i Moraxella sp. Oczekiwane rezultaty to:

1. coli: Fermentor glukozy (probówki żółte i musujące).
2. aeruginosa: utleniacz glukozy (otwarta żółta rurka i zielona lub niebieska uszczelka).
3. Moraxella sp: nie jest sacharolityczny (zielona lub niebieska probówka otwarta, zielona szczelna probówka).

Ograniczenia

-Niektóre mikroorganizmy nie mogą rosnąć w pożywce OF. W takich przypadkach test powtarza się, ale do pożywki dodaje się 2% surowicy lub 0,1% ekstraktu drożdżowego.

-Reakcje utleniania są często obserwowane tylko blisko powierzchni, a reszta pożywki może pozostać zielona, ​​w ten sam sposób, w jaki jest uważana za pozytywną.

Bibliografia

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
3. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne do identyfikacji bakterii o znaczeniu klinicznym. 3rd ed. Od redakcji Panamericana. Buenos Aires. Argentyna.
4. Francisco Soria Melguizo Laboratories. 2009. OF Glucose Medium. Dostępne pod adresem: http://f-soria.es
5. Conda Pronadisa Laboratories. Pożywki glukozowej. Dostępne pod adresem: condalab.com
6. BD Laboratories. 2007. OF Basal Medium. Dostępne na: bd.com