MIKROMACIERZE DNA: PROCEDURA I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2025

Mikromacierzy DNA , zwany również układ DNA lub mikromacierzy DNA, składający się z szeregu fragmentów DNA mocowana do fizycznego nośnika zmiennego materiału, albo z tworzywa sztucznego lub szkła. Każdy fragment DNA reprezentuje sekwencję komplementarną do określonego genu.

Głównym celem mikromacierzy jest badanie porównawcze ekspresji określonych genów będących przedmiotem zainteresowania. Na przykład często stosuje się tę technikę do dwóch próbek - jednej w zdrowych warunkach i jednej patologicznej - w celu zidentyfikowania, które geny ulegają ekspresji, a których nie ma w próbce z chorobą. Wspomnianą próbką może być komórka lub tkanka.

Autor: Paphrag z angielskiej Wikipedii (przeniesione z en.wikipedia do Commons.), Via Wikimedia Commons

Generalnie ekspresję genów można wykryć i określić ilościowo dzięki zastosowaniu cząsteczek fluorescencyjnych. W większości przypadków manipulacja chipami jest wykonywana przez robota i jednocześnie można analizować dużą liczbę genów.

Ta nowatorska technologia jest przydatna w wielu dyscyplinach, od diagnostyki medycznej po różne badania biologii molekularnej w dziedzinie proteomiki i genomiki.

Z czego to się składa?

Mikromacierze DNA (kwasu dezoksyrybonukleinowego) to zestaw specyficznych segmentów DNA przyłączonych do stałej matrycy. Sekwencje te są komplementarne do genów, które chcą być badane, a na cm ² może przypadać do 10 000 genów .

Cechy te pozwalają na systematyczne i masowe badanie ekspresji genów organizmu.

Informacje potrzebne komórce do funkcjonowania są zakodowane w jednostkach zwanych „genami”. Niektóre geny zawierają instrukcje dotyczące tworzenia podstawowych cząsteczek biologicznych zwanych białkami.

Gen ulega ekspresji, jeśli jego DNA jest transkrybowane na pośrednią cząsteczkę informacyjnego RNA, a ekspresja genu może się różnić w zależności od poziomu transkrypcji tego segmentu DNA. W niektórych przypadkach zmiana wyrazu może wskazywać na choroby.

Zasada hybrydyzacji umożliwia działanie mikromacierzy. DNA to cząsteczka złożona z czterech rodzajów nukleotydów: adeniny, tyminy, guaniny i cytozyny.

Aby utworzyć strukturę podwójnej helisy, grupy adeniny z tyminą i cytozyną z guaniną. Zatem dwa komplementarne łańcuchy mogą być połączone wiązaniami wodorowymi.

Rodzaje mikromacierzy

Pod względem struktury mikromacierzy istnieją dwie odmiany: wykonane na zamówienie komplementarne DNA lub oligonukleotydy oraz komercyjne mikromacierze o dużej gęstości produkowane przez firmy komercyjne, takie jak Affymetrix GeneChip.

Pierwszy typ mikromacierzy umożliwia analizę RNA z dwóch różnych próbek na jednym chipie, podczas gdy druga odmiana jest typu komercyjnego i ma dużą liczbę genów (na przykład Affymetrix GeneChip ma około 12000 genów ludzkich), umożliwiając analizę pojedyncza próbka.

Proces

Izolacja RNA

Pierwszym krokiem w przeprowadzeniu eksperymentu z wykorzystaniem technologii mikromacierzy jest izolacja i oczyszczenie cząsteczek RNA (może to być informacyjny RNA lub inne typy RNA).

Jeśli chcesz porównać dwie próbki (między innymi zdrowe i chore, kontrolne i leczone), należy przeprowadzić izolację cząsteczki w obu tkankach.

Produkcja i znakowanie cDNA

Następnie RNA poddaje się procesowi odwrotnej transkrypcji w obecności wyznakowanych nukleotydów i w ten sposób otrzymane zostanie komplementarne DNA lub cDNA.

Znacznik może być fluorescencyjny i musi być rozróżnialny między dwiema analizowanymi tkankami. W tradycyjny sposób stosowane są związki fluorescencyjne Cy3 i Cy5, ponieważ emitują one fluorescencję przy różnych długościach fal. W przypadku Cy3 jest to kolor zbliżony do czerwonego, a Cy5 odpowiada widmie pomiędzy pomarańczą i żółcią.

Hybrydyzacja

CDNA miesza się i inkubuje w mikromacierzy DNA, aby umożliwić hybrydyzację (tj. Następuje wiązanie) cDNA z obu próbek z częścią DNA unieruchomioną na stałej powierzchni mikromacierzy.

Większy procent hybrydyzacji z sondą w mikromacierzy jest interpretowany jako wyższa ekspresja tkankowa odpowiedniego mRNA.

Odczyt systemu

Kwantyfikację ekspresji przeprowadza się przez włączenie systemu czytnika, który przypisuje kod koloru do ilości fluorescencji emitowanej przez każdy cDNA. Na przykład, jeśli kolor czerwony jest używany do oznaczenia stanu patologicznego i hybrydyzuje w większej proporcji, składnik czerwony będzie dominującym.

Dzięki temu systemowi można poznać nadekspresję lub represję każdego analizowanego genu w obu wybranych warunkach. Innymi słowy, można poznać transkryptom próbek ocenianych w eksperymencie.

Larssono, źródło Wikimedia Commons

Aplikacje

Obecnie mikromacierze są uważane za bardzo potężne narzędzia w dziedzinie medycyny. Ta nowa technologia umożliwia diagnozowanie chorób i lepsze zrozumienie, w jaki sposób ekspresja genów jest modyfikowana w różnych warunkach medycznych.

Ponadto pozwala na porównanie tkanki kontrolnej i tkanki poddanej działaniu określonego leku w celu zbadania skutków ewentualnego leczenia.

W tym celu porównuje się stan normalny i stan chorobowy przed i po podaniu leku. Badając wpływ leku na genom in vivo, mamy lepszy przegląd mechanizmu jego działania. Można również zrozumieć, dlaczego niektóre konkretne leki powodują niepożądane skutki uboczne.

Rak

Rak znajduje się na szczycie list chorób badanych za pomocą mikromacierzy DNA. Metodologia ta została wykorzystana do klasyfikacji i prognozowania choroby, szczególnie w przypadkach białaczek.

Dziedzina badań tego schorzenia obejmuje kompresję i charakterystykę molekularnych podstaw komórek rakowych w celu znalezienia wzorców ekspresji genów, które skutkują niepowodzeniami w regulacji cyklu komórkowego oraz w procesach śmierci komórki (lub apoptozy).

Inne choroby

Dzięki zastosowaniu mikromacierzy możliwe było wyjaśnienie zróżnicowanych profili ekspresji genów w chorobach alergii, pierwotnych niedoborach odporności, chorobach autoimmunologicznych (takich jak reumatoidalne zapalenie stawów) i chorobach zakaźnych.

Bibliografia

1. Bednar, M. (2000). Technologia i zastosowanie mikromacierzy DNA. Monitor nauk medycznych, 6 (4), MT796-MT800.
2. Kurella, M., Hsiao, LL, Yoshida, T., Randall, JD, Chow, G., Sarang, SS,… & Gullans, SR (2001). Analiza mikromacierzy DNA złożonych procesów biologicznych. Journal of the American Society of Nephrology, 12 (5), 1072-1078.
3. Nguyen, DV, Bulak Arpat, A., Wang, N. i Carroll, RJ (2002). Eksperymenty z mikromacierzami DNA: aspekty biologiczne i technologiczne. Biometrics, 58 (4), 701–717.
4. Plous, CV (2007). Mikromacierze DNA i ich zastosowania w badaniach biomedycznych. Magazyn CENIC. Biological Sciences, 38 (2), 132–135.
5. Wiltgen, M. i Tilz, GP (2007). Analiza mikromacierzy DNA: zasady i wpływ kliniczny. Hematology, 12 (4), 271–287.