BARWIENIE HEMATOKSYLINĄ-EOZYNĄ: CHARAKTERYSTYKA, ZASTOSOWANIA, TECHNIKI - CHEMIA - 2025

Hematoksyliną - eozyną jest technika barwienia przy użyciu kombinacji barwników hematoksyliną i eozyną. Ta para barwników tworzy doskonały duet, ponieważ hematoksylina działa jako barwnik zasadowy, a eozyna jest barwnikiem kwasowym.

Oznaczenie barwników zasadowych lub kwasowych nie odnosi się do pH, które uzyskują w roztworze, ale raczej mówi o przeważającej proporcji pod względem posiadanych ładunków anionowych lub kationowych lub przez lokalizację grupy chromoforowej.

Hematoksylina - nabłonek rzęskowy kolumnowy barwiony eozyną (HE) Źródło: Todd Straus i Vladimir Osipov

W tym sensie hematoksylinę uważa się za barwnik zasadowy (kationowy) i dlatego wykazuje powinowactwo do struktur kwasowych, takich jak jądro komórkowe. Natomiast eozyna, będąc barwnikiem kwasowym (anionowym), wykazuje powinowactwo do struktur zasadowych lub zasadowych, takich jak cytoplazma komórki.

Z tego powodu ta kombinacja barwników jest szeroko stosowana do barwienia tkanek, ponieważ umożliwia wyraźne rozróżnienie jąder komórkowych i cytoplazmy. Jądra wybarwiają się na ciemnoniebiesko lub fioletowo, a cytoplazma na różowo.

Barwienie hematoksyliną i eozyną jest jedną z najczęściej stosowanych technik barwienia w dziedzinie histologii i cytologii, ze względu na łatwą obsługę i niski koszt. Służy do wizualizacji komórek, grubych włókien nerwowych oraz obecności w tkankach określonych mikroorganizmów, takich jak m.in. pasożyty, grzyby i bakterie.

cechy

Hematoksylina

Hematoksylina jest barwnikiem neutralnym. Jednak składnik zapewniający kolor (chromofor) znajduje się w kationowym lub zasadowym centrum cząsteczki. Stąd jego powinowactwo do struktur kwasowych. Jego wzór chemiczny to C ₁₆ H ₁₄ O _6, a nazwa naukowa to 7,11b-dihydroindeno chromene-3, 4,6a, 9,10 (6 H) -pentol.

Barwi głównie jądra komórek, ponieważ są one bardzo bogate w kwasy nukleinowe. Może również barwić wtrącenia cytoplazmatyczne pochodzenia wirusowego.

Aby hematoksylina mogła się zabarwić, musi być w stanie utlenionym i związana z metalem. Ten ostatni będzie służył do mocowania do tkanki, to znaczy będzie działał jak zjadacz.

Utleniona hematoksylina nazywana jest hemateiną. Utlenianie następuje poprzez wystawienie na działanie tlenu (starzenie) odczynnika lub przez substancje, które wspomagają jego utlenianie (utlenianie chemiczne).

Eosin

Eozyna to barwnik barwiący na czerwono lub różowo. Jest nierozpuszczalny w wodzie, chociaż istnieje wersja rozpuszczalna w wodzie. Generalnie eozynę wytwarza się przez rozpuszczenie w alkoholu (etanol 95 °).

Barwi cytoplazmy, włókna mięśniowe, organelle cytoplazmatyczne i kolagen, ale nie plami jąder komórkowych. Dzieje się tak, ponieważ jest naładowany ujemnie, a zatem ma powinowactwo do struktur naładowanych dodatnio.

Istnieją dwa rodzaje eozyny „Y” i „B”. Eozyna „Y” jest znana jako żółta eozyna. Jego nazwa naukowa to tetrabromo-fluoresceina, a wzór chemiczny to C ₂₀ H ₈ Br ₄ O ₅ .

Z drugiej strony eozyna „B” jest czasami nazywana niebieskawą erytrozyną B. Jego nazwa naukowa to dibromodynitro fl uoresceina, a jej wzór to C ₂₀ H ₈ Br ₂ N ₂ O ₉ . Oba są bardzo podobne, a różnica między używaniem jednego lub drugiego nie jest tak naprawdę zauważalna. Jednak najpopularniejsza jest eozyna „Y”.

Eozyna ma właściwość rozróżniania między żywą a martwą komórką, ponieważ jest zdolna do przejścia przez błonę tylko wtedy, gdy komórki są martwe, aby zabarwić cytoplazmę, pozostawiając cytoplazmę komórki bezbarwną, jeśli pozostaje żywa.

Aplikacje

Barwienie włókien nerwowych

Grube włókna nerwowe można zabarwić i zidentyfikować za pomocą hematoksyliny-eozyny. Nie jest jednak przydatny do barwienia cienkich włókien nerwowych, ponieważ do ich uwidocznienia wymagane jest zabarwienie srebrem.

Histologiczne plamy na skrawkach skóry

W barwieniu zrogowaciałej warstwy skóry działającym barwnikiem jest eozyna, ponieważ na tym poziomie komórki nie mają jądra komórkowego.

W ziarnistej warstwie skóry hematoksylina silnie zabarwia granulki keratohialiny wewnątrz komórek ziarnistych. Wręcz przeciwnie, kolczasta warstwa skóry jest słabo zabarwiona hematoksyliną, podczas gdy warstwa podstawna lub zarodkowa jest dość poplamiona.

Eozyna zabarwia cytoplazmę wszystkich komórek, a intensywność koloru może się różnić w zależności od warstwy.

Barwienie próbek kału hematoksyliną i eozyną

Gómez i wsp., W 2005 roku wykazali, że barwienie hematoksyliną i eozyną było skuteczniejsze w identyfikowaniu przypadków pełzakowicy wywołanej różnicami Entamoeba histolytica i Entamoeba niż metoda świeżej wizualizacji (sól fizjologiczna i lugol) u pacjentów z ostrą biegunką.

Wykazano również, że jest bardzo czuły w wykrywaniu erytrofagocytozy (ameby, które pochłonęły erytrocyty).

Barwienie skrawków histologicznych do diagnostyki infekcji

Walwyn i wsp., W 2004 roku zaproponowali zastosowanie barwienia histologicznego do wykrywania mikroorganizmów wywołujących zakażenia.

Używając barwienia hematoksyliną i eozyną, byli w stanie zwizualizować infekcje wywołane przez Clostridium, Actinomyces, spirillae lub Candida. Udało im się również zaobserwować obecność pasożyta Sarcoptes escabiei w skrawkach skóry oraz wtręty wirusowe cytomegalowirusa i opryszczki w skrawkach różnych tkanek.

Techniki

Do próbek histologicznych

Barwienie skrawków histologicznych przebiega w kilku etapach. Pierwszą rzeczą jest uzyskanie sekcji histologicznej. Należy to woskować, aby później uzyskać nacięcia (ultradrobne) za pomocą mikrotomu. Technika składa się z następujących kroków:

1-Eliminacja nadmiaru parafiny : w tym celu możesz użyć ksylolu lub Heme-D, zanurzyć na 3-5 minut.

2-Ponowne uwodnienie próbki: osiąga się to przez zanurzenie próbki w różnych stężeniach alkoholi (etanolu) w porządku malejącym (100 °, 90 °, 70 °). We wszystkich przypadkach przez 7 minut.

3-Eliminacja nadmiaru alkoholu: w tym celu zanurza się go w wodzie na 7 minut.

4-Barwienie hematoksyliną: próbkę zanurza się na 6-10 minut w tacy zawierającej hematoksylinę. Czas ekspozycji zależy od wielkości i grubości próbki.

5-Eliminacja nadmiaru hematoksyliny: przemywa się ją wodą przez 5 minut, a następnie przeprowadza się szybkie przejście (10-20 sekund) przez kwaśny alkohol. Później ponownie myje się wodą przez 5 minut. Następnie zanurza się go w etanolu w 96 ° na 1 minutę.

6-Barwienie eozyną: w tym celu próbkę zanurza się na 5 minut w tacce z eozyną.

7-Odwodnienie próbki : w tym celu przechodzi przez tace z alkoholem (etanol), ale tym razem w kolejności rosnącej. (70 °, 90 °, 100 °). (Odpowiednio przez 5 sekund, 5 sekund, 1 minutę).

8-Wyjaśnienie próbki : w tym celu poddaje się ją działaniu ksylolu przez 5–10 minut i suszy w celu trwałego uszczelnienia balsamem kanadyjskim lub innym podobnym materiałem.

Do szukania próbek kału

Na szkiełku wykonuje się wymaz ze stolcem pacjenta i utrwala 80% alkoholem przez 5 minut. Arkusz zanurza się w hematoksylinie na 5 minut i natychmiast przemywa wodą.

Następnie szybko zanurza się go w kwaśnym alkoholu, a następnie w wodzie amoniakalnej. Jest myty wodą. Jest barwiony przez 5 minut w eozynie. Próbkę odwadnia się, jak wyjaśniono w stanie techniki, i na koniec przepłukuje ksylenem.

Przygotowanie odczynników

- Hematoksylina

W jednym litrze wody destylowanej rozpuść 50 gramów siarczanu glinu potasu lub amonu. Po całkowitym rozpuszczeniu dodać 1 gram wykrystalizowanej hematoksyliny. Po całkowitym rozpuszczeniu dodaje się 1 g kwasu cytrynowego razem z 50 g wodzianu chloralu i 0,2 g jodanu sodu.

Mieszaninę gotuje się przez 5 minut, a następnie pozostawia do ostygnięcia i filtruje w celu usunięcia wszelkich pozostałych cząstek stałych. Tak przygotowany odczynnik może być użyty natychmiast.

- Eosin

Można go przygotować na bazie alkoholu lub na bazie wody.

Eozyna alkoholowa

W 100 ml etanolu w 95 ° rozpuść 0,5 grama eozyny „Y”. Następnie dodaj kilka kropli lodowatego kwasu octowego.

2% wodna eozyna

W 1250 ml wody destylowanej rozpuść 25 gramów rozpuszczalnej w wodzie eozyny „Y”. Następnie dodaj kilka kropli lodowatego kwasu octowego.

Kwaśny alkohol

Odmierzyć 0,5 ml stężonego kwasu solnego i dopełnić do 100 ml alkoholem absolutnym.

Woda amoniakalna

Odmierz 0,5 ml stężonego amoniaku i uzupełnij do 100 ml wodą destylowaną.

Bibliografia

1. Navarrete, G. Histology of the skin. Rev Fac Med UNAM 2003; 46 (4): 130–133. Dostępne pod adresem: medigraphic.com
2. Gómez-Rivera N, Molina A, García M, Castillo J, Castillo J, García R, Fonseca I, Valenzuela O.
3. Identyfikacja Entamoeba histolytica / E. Różni się techniką świeżej ameby w porównaniu z barwieniem hematoksyliną-eozyną w ostrej biegunce. Rev Mex Pediatr 2005; 72 ust. 3; 109-112. Dostępne pod adresem: medigraphic.com
4. Walwyn V, Iglesias M, Almarales M, Acosta N, Mera A, Cabrejas M. Przydatność technik histologicznych w diagnostyce zakażeń w preparatach anatomicznych. Rev Cub Med Mil, 2004; 33 ust. 2. Dostępne pod adresem: scielo.sld
5. Odczynniki PanReac AppliChem ITW. Barwienie hematoksyliną i eozyną. 2017, Hiszpania. Dostępne pod adresem: itwreagents.com
6. Eosin. Wikipedia, wolna encyklopedia. 7 listopada 2018, 08:18 UTC. 4 sierpnia 2019, 22:13 en.wikipedia.org
7. „Hematoksylina”. Wikipedia, wolna encyklopedia. 3 maja 2019, 11:23 UTC. 4 sierpnia 2019, 22:48 wikipedia.org