CYTOCHEMIA: HISTORIA, PRZEDMIOT BADAŃ, UŻYTECZNOŚĆ I TECHNIKI - BIOLOGIA - 2026

Cytochemia składa się z szeregu technik, które opierają się na identyfikacji i rozmieszczenie poszczególnych substancji w komórce. Uważana jest za gałąź biologii komórki, która łączy morfologię komórki ze strukturą chemiczną.

Zdaniem Bensleya, twórcy zastosowania współczesnej cytologii, stwierdza, że ​​celem cytochemii jest odkrycie chemicznej organizacji komórek w celu zrozumienia tajemnic życia. Oprócz badania dynamicznych zmian zachodzących na różnych etapach funkcjonalnych.

1: choroba pozasutkowa Pageta. (Hematoxylin-Eosin) 2: płytki starcze obserwowane w korze mózgowej u pacjenta z chorobą Alzheimera. (Impregnacja srebrem) 3: Język królika, Włókna kolagenowe (niebieskie). Włókna mięśniowe (fioletowe paski). (Trichrom Massona). 4: Tkanka wątroby ze zwyrodnieniem tłuszczowym. (Sudan III) 5: Zapalenie wątroby. Martwica. (Błękit toluidynowy) Źródła: Wikipedia. com / Użytkownik: KGH / Pliki domeny publicznej / Mohit Lalwani

W ten sposób można określić rolę metaboliczną, jaką odgrywają te substancje w komórce.

Cytochemia wykorzystuje dwie główne metody. Pierwsza opiera się na procedurach chemicznych i fizycznych. Techniki te wykorzystują mikroskop jako niezbędny instrument do wizualizacji reakcji chemicznych zachodzących na określonych substancjach w komórce.

Przykład: zastosowanie barwników cytochemicznych, takich jak m.in. reakcja Feulgena lub reakcja PAS.

Druga metoda oparta jest na biochemii i mikrochemii. Dzięki tej metodologii możliwe jest ilościowe określenie obecności wewnątrzkomórkowych substancji chemicznych.

Wśród substancji, które można ujawnić w strukturze tkanki lub komórki, są: białka, kwasy nukleinowe, polisacharydy i lipidy.

Historia cytochemii

Techniki cytochemiczne od czasu ich wynalezienia pomogły w zrozumieniu składu komórek iz biegiem czasu pojawiły się różne techniki wykorzystujące różne typy barwników o odmiennych podobieństwach i podstawach.

Następnie cytochemia otworzyła nowe horyzonty z wykorzystaniem określonych substratów, aby kolorymetrycznie wykazać obecność enzymów lub innych cząsteczek w komórce.

Podobnie, pojawiły się inne techniki, takie jak immunocytochemia, która okazała się bardzo pomocna w diagnostyce wielu chorób. Immunocytochemia opiera się na reakcjach antygen-przeciwciało.

Z drugiej strony, w cytochemii wykorzystano również substancje fluorescencyjne zwane fluorochromami, które są doskonałymi markerami do wykrywania pewnych struktur komórkowych. Dzięki właściwościom fluorochromu uwydatnia struktury, do których został przyczepiony.

Co studiujesz?

Różne techniki cytochemiczne stosowane na próbce biologicznej mają coś wspólnego: ujawniają obecność określonego rodzaju substancji i znają jej położenie w ocenianej strukturze biologicznej, czy to w komórce, czy w tkance.

Substancje te mogą być enzymami, metalami ciężkimi, lipidami, glikogenem i określonymi grupami chemicznymi (aldehydy, tyrozyna itp.).

Informacje dostarczane przez te techniki mogą dostarczyć wskazówek nie tylko do identyfikacji komórek, ale także do diagnozy różnych patologii.

Na przykład barwienie cytochemiczne jest bardzo przydatne w rozróżnianiu różnych typów białaczek, ponieważ niektóre komórki wyrażają określone enzymy lub kluczowe substancje, a inne nie.

Z drugiej strony należy zauważyć, że aby zastosowanie cytochemii było możliwe, należy wziąć pod uwagę następujące kwestie:

1) Substancja musi zostać unieruchomiona w miejscu, w którym występuje naturalnie.

2) Substancję należy zidentyfikować za pomocą substratów, które reagują z nią specyficznie, a nie z innymi związkami.

Użyteczność

Próbki, które można badać technikami cytochemicznymi, to:

- Rozszerzona krew obwodowa.

- Rozszerzony szpik kostny.

- Tkanki utrwalone do technik histochemicznych.

- Komórki utrwalone przez cytowirowanie.

Techniki cytochemiczne są bardzo pomocne w dziedzinie hematologii, ponieważ są szeroko stosowane jako pomoc w diagnozowaniu i różnicowaniu niektórych typów białaczek.

Na przykład: Reakcje esterazy służą do różnicowania białaczki mielomonocytowej od ostrej białaczki monocytowej.

Rozmaz szpiku kostnego i krwi obwodowej tych pacjentów są podobne, ponieważ niektóre komórki są trudne do zidentyfikowania pod względem morfologicznym. W tym celu przeprowadza się test esterazy.

W pierwszym przypadku pozytywne są specyficzne esterazy, w drugim niespecyficzne esterazy są dodatnie.

Są również bardzo przydatne w histologii, ponieważ np. Zastosowanie techniki barwienia metalami ciężkimi (impregnacja srebrem) powoduje wybarwienie włókien siatkowatych w tkance mięśnia sercowego na intensywnie brązowy kolor.

Techniki cytochemii

Najczęściej używane techniki zostaną wyjaśnione poniżej:

- Stosowanie barwników

Zastosowane barwniki są bardzo zróżnicowane pod względem technik cytochemicznych i można je sklasyfikować według kilku punktów widzenia:

Zgodnie z radykałem, do którego mają powinowactwo

Dzielą się na: kwaśne, zasadowe lub neutralne. Są najprostsze i najczęściej używane w historii, co pozwala nam odróżnić składniki zasadochłonne od kwasofilnych. Przykład: barwienie hematoksyliną-eozyną.

W tym przypadku jądra komórek wybarwiają się na niebiesko (pobierają hematoksylinę, która jest podstawowym zabarwieniem), a cytoplazmy na czerwono (pobierają eozynę, która jest zabarwieniem kwasowym).

W zależności od koloru, który zapewniają

Mogą być ortochromatyczne lub metachromatyczne. Ortochromaty to te, które plamią struktury na ten sam kolor, co barwnik. Na przykład przypadek eozyny, której kolor jest czerwony i plami się na czerwono.

Z drugiej strony metachromaty wybarwiają struktury o innym kolorze niż ich własny, jak np. Toluidyna, której kolor jest niebieski, a jednak barwi na fioletowo.

Barwniki życiowe lub supravital

Są nieszkodliwymi barwnikami, to znaczy barwią komórki i pozostają przy życiu. Plamy te nazywane są żywymi (np. Błękit trypanowy do barwienia makrofagów) lub nadciśnieniem (np. Zieleń Janusa do barwienia mitochondriów lub obojętna czerwień do barwienia lizosomów).

- Wykrywanie lipidów za pomocą barwników rozpuszczalnych w tłuszczach

Czterotlenek osmu

Zabarwia lipidy (nienasycone kwasy tłuszczowe) na czarno. Reakcję tę można obserwować pod mikroskopem świetlnym, ale ponieważ barwnik ten ma dużą gęstość, można go również zwizualizować pod mikroskopem elektronowym.

Sudan III

Jest jednym z najczęściej używanych. Ten barwnik dyfunduje i rozpuszcza się w tkankach, gromadząc się wewnątrz kropelek lipidów. Kolor jest szkarłatny.

Sudan czarna plama B.

Daje lepszy kontrast niż poprzednie, ponieważ jest w stanie rozpuszczać się również w fosfolipidach i cholesterolu. Jest przydatna do wykrywania ziarnistości azurofilnych i specyficznych dojrzałych granulocytów i ich prekursorów. Dlatego identyfikuje białaczki szpikowe.

- Barwienie grup aldehydowych (barwienie kwasem nadjodowym Schiffa)

Barwienie Schiffa kwasem nadjodowym może wykryć trzy rodzaje grup aldehydowych. Oni są:

- Wolne aldehydy, naturalnie obecne w tkankach (reakcja plazmowa).

- Aldehydy powstające w wyniku selektywnego utleniania (reakcja PAS).

- Aldehydy powstające w wyniku selektywnej hydrolizy (reakcja Feulgena).

Reakcja PAS

To barwienie opiera się na wykrywaniu pewnych rodzajów węglowodanów, takich jak glikogen. Kwas nadjodowy Schiffa zrywa wiązania CC węglowodanów w wyniku utleniania grup glikolowych 1-2, uwalniając grupy aldehydowe.

Wolne grupy aldehydowe reagują z odczynnikiem Schiffa i tworzą fioletowo-czerwony związek. Pojawienie się fioletowo-czerwonego koloru świadczy o pozytywnej reakcji.

Ten test jest pozytywny w komórkach roślinnych, wykrywając skrobię, celulozę, hemicelulozę i peptyny. W komórkach zwierzęcych wykrywa mucyny, mukoproteiny, kwas hialuronowy i chitynę.

Ponadto jest przydatny w diagnostyce białaczek limfoblastycznych czy erytroleukemii, wśród innych patologii typu mielodysplastycznego.

W przypadku kwaśnych węglowodanów można zastosować barwnik z błękitem alcjanowym. Wynik testu jest pozytywny, jeśli obserwuje się jasnoniebiesko-turkusowy kolor.

Reakcja plazmowa

Reakcja plazmowa ujawnia obecność pewnych długołańcuchowych aldehydów alifatycznych, takich jak palmowy i stearalowy. Technikę tę stosuje się na zamrożonych skrawkach histologicznych. Jest traktowany bezpośrednio odczynnikiem Schiffa.

Reakcja Feulgena

Ta technika wykrywa obecność DNA. Technika polega na poddaniu utrwalonej tkanki hydrolizie słabo kwasowej, aby później zareagowała z odczynnikiem Schiffa.

Hydroliza odsłania grupy aldehydowe dezoksyrybozy na połączeniu deoksyrybozy-puryny. Odczynnik Schiffa reaguje następnie z grupami aldehydowymi, które pozostały wolne.

Ta reakcja jest dodatnia w jądrach i ujemna w cytoplazmie komórek. O pozytywności świadczy obecność koloru czerwonego.

Jeśli ta technika jest połączona z zieloną metylopironiną, możliwe jest jednoczesne wykrycie DNA i RNA.

- Barwienie cytochemiczne struktur białkowych

W tym celu można zastosować reakcję Millona, ​​w której jako odczynnik stosuje się azotan rtęci. Struktury zawierające aminokwasy aromatyczne zabarwiają się na czerwono.

- Barwienie cytochemiczne wykorzystujące substraty do wykazania obecności enzymów

Te plamy są oparte na inkubacji próbki biologicznej z określonym substratem, a produkt reakcji następnie reaguje z solami diazowymi, tworząc kolorowy kompleks.

Esterazy

Enzymy te są obecne w lizosomach niektórych krwinek i są zdolne do hydrolizy estrów organicznych, uwalniając naftol. Ten ostatni tworzy nierozpuszczalny barwnik azowy, gdy wiąże się z solą dwuazową, zabarwiając miejsce, w którym zachodzi reakcja.

Istnieje kilka substratów iw zależności od tego, który z nich jest stosowany, można zidentyfikować specyficzne esterazy i niespecyficzne esterazy. Te pierwsze są obecne w niedojrzałych komórkach serii mieloidalnej, a drugie w komórkach pochodzenia monocytarnego.

Substratem używanym do oznaczania specyficznych esteraz jest: chlorooctan naftolu-AS-D. Podczas gdy do oznaczania nieswoistych esteraz można zastosować kilka substratów, takich jak octan naftolu AS-D, octan alfa naftylu i maślan alfa naftylu.

W obu przypadkach komórki zabarwiają się na głęboką czerwono, gdy reakcja jest pozytywna.

Mieloperoksydaza

Enzym ten znajduje się w ziarnistości azurofilowej komórek granulocytów i monocytów.

Jej wykrywanie służy do różnicowania białaczek pochodzenia szpikowego od limfoidalnych. Komórki zawierające mieloperoksydazy zmieniają kolor na ochrowo-żółty.

Fosfatazy

Te enzymy uwalniają kwasy fosforowe z różnych substratów. Różnią się one od siebie specyfiką podłoża, pH oraz działaniem inhibitorów i inaktywatorów.

Do najbardziej znanych należą fosfomonoesterazy, które hydrolizują proste estry (PO). Przykład: fosfataza alkaliczna i fosfataza kwaśna, a także fosfamidazy, które hydrolizują wiązania (PN). Służą one do różnicowania zespołów limfoproliferacyjnych oraz do diagnostyki białaczki włochatokomórkowej.

- Zabarwienia trichromiczne

Trichrom Mallary-Azan

Są przydatne do różnicowania cytoplazmy komórek z włókien tkanki łącznej. Komórki zabarwiają się na czerwono, a włókna kolagenowe na niebiesko.

Trichrom Massona

Ma to taką samą użyteczność jak poprzednia, ale w tym przypadku komórki zabarwiają się na czerwono, a włókna kolagenowe na zielono.

- Barwniki, które plamią określone organelle

Janus Green

Selektywnie plami mitochondria.

Sole srebra i kwas osmowy

Plami aparat Golgiego.

Błękit toluidynowy

Plami ciała Nissi

Sole srebra i PAS

Barwią włókna siatkowate i blaszkę podstawną.

Rezorcyna orceina i fuksyna

Barwią elastyczne włókna. Pierwsza jest barwiona na brązowo, a druga na ciemnoniebieską lub fioletową.

- Inne techniki stosowane w cytochemii

Stosowanie substancji fluorescencyjnych lub fluorochromów

Istnieją techniki wykorzystujące substancje fluorescencyjne do badania położenia struktury w komórce. Reakcje te są wizualizowane za pomocą specjalnego mikroskopu zwanego fluorescencją. Przykład: technika IFI (immunofluorescencja pośrednia).

Wykrywanie składników komórkowych metodą immunocytochemii

Techniki te są bardzo przydatne w medycynie, ponieważ pomagają wykryć określoną strukturę komórkową, a także ją określić ilościowo. Ta reakcja jest oparta na reakcji antygen-przeciwciało. Na przykład: techniki ELISA (Enzyme Immuno Assay).

zalecenia

- Do oceny dobrego działania barwników konieczne jest użycie rozmazów kontrolnych.

- Do wykonania barwienia cytochemicznego należy użyć świeżych rozmazów. Jeśli nie jest to możliwe, należy je chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 ° C.

- Należy uważać, aby stosowany utrwalacz nie wpływał negatywnie na badaną substancję. Innymi słowy, należy uniemożliwić jej wydobywanie lub hamowanie.

- Należy przestrzegać czasu stosowania utrwalaczy, ponieważ generalnie powinien on trwać tylko kilka sekund, ponieważ dłuższe wystawianie rozmazu na działanie utrwalacza może spowodować uszkodzenie niektórych enzymów.

Bibliografia

1. „Cytochemia”. Wikipedia, wolna encyklopedia. 30 czerwca 2018, 17:34 UTC. 9 Jul 2019, 02:53 Dostępne na: wikipedia.org
2. Villarroel P, de Suárez C. Metallic Impregnation Methods for the Study of Myocardial Reticular Fibers: Badanie porównawcze. RFM 2002; 25 (2): 224-230. Dostępne pod adresem: scielo.org
3. Santana A, Lemes A, Bolaños B, Parra A, Martín M, Molero T. Cytochemistry of acid phosphatase: rozważania metodologiczne. Rev Diagn Biol.200; 50 (2): 89-92. Dostępne pod adresem: scielo.org
4. De Robertis E, De Robertis M. (1986). Biologia komórkowa i molekularna. Wydanie 11. Od redakcji Ateneo. Buenos Aires, Argentyna.
5. Klasyczne narzędzia do badania biologii komórki. TP 1 (materiał uzupełniający) - Biologia komórki. Dostępne pod adresem: dbbe.fcen.uba.ar