ENZYMY RESTRYKCYJNE: FUNKCJE, TYPY I PRZYKŁADY - BIOLOGIA - 2025

Te enzymy restrykcyjne są endonukleazy archeonów przez niektóre bakterie i hamować lub „ograniczenie” rozprzestrzeniania się wirusa w środku. Są szczególnie powszechne u bakterii i stanowią część ich systemu obronnego przed obcym DNA, znanym jako system restrykcji / modyfikacji.

Enzymy te katalizują rozszczepianie dwupasmowego DNA w określonych miejscach, w sposób powtarzalny i bez użycia dodatkowej energii. Większość wymaga obecności kofaktorów, takich jak magnez lub inne dwuwartościowe kationy, chociaż niektóre wymagają również ATP lub S-adenozylometioniny.

Schemat reakcji enzymu restrykcyjnego HindIII (źródło: Helixitta za Wikimedia Commons)

Endonukleazy restrykcyjne zostały odkryte w 1978 roku przez Daniela Nathansa, Arbera Wernera i Hamiltona Smitha, którzy za swoje odkrycie otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny. Ich nazwa ogólnie pochodzi od organizmu, w którym zostały po raz pierwszy zaobserwowane.

Takie enzymy są szeroko stosowane w opracowywaniu metod klonowania DNA i innych strategii biologii molekularnej i inżynierii genetycznej. Ich specyficzne cechy rozpoznawania sekwencji i możliwość cięcia sekwencji w pobliżu miejsc rozpoznawania sprawiają, że są one potężnymi narzędziami do eksperymentów genetycznych.

Fragmenty wygenerowane przez enzymy restrykcyjne, które oddziałują na określoną cząsteczkę DNA, można wykorzystać do odtworzenia „mapy” oryginalnej cząsteczki, wykorzystując informacje o miejscach, w których enzym tnie DNA.

Niektóre enzymy restrykcyjne mogą mieć to samo miejsce rozpoznawane w DNA, ale niekoniecznie przecinają je w ten sam sposób. Zatem istnieją enzymy, które tną, pozostawiając tępe końce i enzymy, które tną, pozostawiając spójne końce, które mają różne zastosowania w biologii molekularnej.

Obecnie na rynku dostępne są setki różnych enzymów restrykcyjnych oferowanych przez różne domy handlowe; Enzymy te pełnią funkcję „niestandardowych” molekularnych nożyczek do różnych celów.

cechy

Enzymy restrykcyjne pełnią odwrotną funkcję polimerazy, ponieważ hydrolizują lub przerywają wiązanie estrowe w obrębie wiązania fosfodiestrowego między sąsiednimi nukleotydami w łańcuchu nukleotydowym.

W biologii molekularnej i inżynierii genetycznej są szeroko stosowanymi narzędziami do budowy wektorów ekspresyjnych i do klonowania, a także do identyfikacji określonych sekwencji. Są również przydatne do budowy rekombinowanych genomów i mają duży potencjał biotechnologiczny.

Niedawne postępy w terapii genowej sprawiają, że obecnie enzymy restrykcyjne są wykorzystywane do wprowadzania określonych genów do wektorów, które są nośnikami transportu takich genów do żywych komórek i które prawdopodobnie mają zdolność wstawiania do genomu komórkowego w celu wykonania trwałe zmiany.

Mechanizm akcji

Enzymy restrykcyjne mogą katalizować dwupasmowe cięcie DNA, chociaż niektóre są zdolne do rozpoznawania jednopasmowych sekwencji DNA, a nawet RNA. Cięcie następuje po rozpoznaniu sekwencji.

Mechanizm działania polega na hydrolizie wiązania fosfodiestrowego pomiędzy grupą fosforanową a dezoksyrybozą w szkielecie każdej nici DNA. Wiele enzymów jest zdolnych do cięcia w tym samym miejscu, które rozpoznają, podczas gdy inne przecinają od 5 do 9 par zasad przed lub po nim.

Enzymy te normalnie odcinają się na końcu 5 'grupy fosforanowej, dając początek fragmentom DNA z końcem 5' fosforylowym i końcem hydroksylowym 3 '.

Ponieważ białka nie wchodzą w bezpośredni kontakt z miejscem rozpoznawanym w DNA, muszą być przemieszczane sukcesywnie, aż do osiągnięcia określonego miejsca, być może za pomocą mechanizmów „ślizgania się” na nici DNA.

Podczas cięcia enzymatycznego wiązanie fosfodiestrowe każdej z nici DNA znajduje się w jednym z aktywnych miejsc enzymów restrykcyjnych. Kiedy enzym opuszcza miejsce rozpoznawania i rozszczepiania, czyni to poprzez nieswoiste przejściowe skojarzenia.

Rodzaje

Obecnie znanych jest pięć typów enzymów restrykcyjnych. Oto krótki opis każdego z nich:

Enzymy restrykcyjne typu I.

Te enzymy są dużymi pentamerycznymi białkami z trzema podjednostkami, jedną do restrykcji, jedną do metylacji i jedną do rozpoznawania sekwencji w DNA. Te endonukleazy są wielofunkcyjnymi białkami zdolnymi do katalizowania reakcji restrykcji i modyfikacji, mają aktywność ATPazy, a także topoizomerazę DNA.

Enzymy tego typu były pierwszymi odkrytymi endonukleazami, zostały po raz pierwszy oczyszczone w latach 60. XX wieku i od tamtej pory były dogłębnie badane.

Enzymy typu I nie są szeroko stosowane jako narzędzie biotechnologiczne, ponieważ miejsce rozszczepienia może znajdować się w zmiennej odległości do 1000 par zasad od miejsca rozpoznania, co czyni je zawodnymi pod względem odtwarzalności eksperymentalnej.

Enzymy restrykcyjne typu II

Są to enzymy złożone z homodimerów lub tetramerów, które tną DNA w określonych miejscach o długości od 4 do 8 pz. Te miejsca rozszczepienia są zazwyczaj palindromiczne, to znaczy rozpoznają sekwencje odczytywane w ten sam sposób w obu kierunkach.

Wiele enzymów restrykcyjnych typu II w bakteriach tnie DNA, gdy rozpoznają jego obcy charakter, ponieważ nie ma on typowych modyfikacji, jakie powinno mieć jego własne DNA.

Są to najprostsze enzymy restrykcyjne, ponieważ nie wymagają żadnego innego kofaktora niż magnez (Mg +) do rozpoznawania i cięcia sekwencji DNA.

Precyzja enzymów restrykcyjnych typu II w rozpoznawaniu i wycinaniu prostych sekwencji w DNA w precyzyjnych pozycjach sprawia, że ​​są one jednymi z najpowszechniej stosowanych i nieodzownych w większości dziedzin biologii molekularnej.

W grupie enzymów restrykcyjnych typu II istnieje wiele podklas sklasyfikowanych według pewnych właściwości, które są unikalne dla każdej z nich. Klasyfikacji tych enzymów dokonuje się poprzez dodanie liter alfabetu od A do Z po nazwie enzymu.

Niektóre z podklas najbardziej znanych ze swojej przydatności to:

Podklasa IIA

Są dimerami różnych podjednostek. Rozpoznają sekwencje asymetryczne i są wykorzystywane jako idealne prekursory do wytwarzania enzymów tnących.

Podklasa IIB

Składają się z jednego lub więcej dimerów i pociętego DNA po obu stronach rozpoznawanej sekwencji. Przecinają obie nici DNA w odstępie par zasad przed miejscem rozpoznania.

Podklasa IIC

Enzymy tego typu to polipeptydy z funkcjami podziału i modyfikacji nici DNA. Enzymy te przecinają asymetrycznie obie nici.

Podklasa IIE

Enzymy z tej podklasy są najczęściej używane w inżynierii genetycznej. Mają miejsce katalityczne i generalnie wymagają allosterycznego efektora. Enzymy te muszą współdziałać z dwiema kopiami ich sekwencji rozpoznawania, aby przeprowadzić wydajne cięcie. W tej podklasie znajdują się enzymy EcoRII i EcoRI.

Enzymy restrykcyjne typu III

Endonukleazy restrykcyjne typu III składają się tylko z dwóch podjednostek, z których jedna jest odpowiedzialna za rozpoznawanie i modyfikację DNA, a druga za rozszczepianie sekwencji.

Enzymy te do swoich funkcji wymagają dwóch kofaktorów: ATP i magnezu. Enzymy restrykcyjne tego typu posiadają dwa asymetryczne miejsca rozpoznawania, dokonują translokacji DNA w sposób zależny od ATP i przecinają go między 20-30 pz w sąsiedztwie miejsca rozpoznawania.

Enzymy restrykcyjne typu IV

Enzymy typu IV są łatwe do zidentyfikowania, ponieważ tną DNA ze śladami metylacji, składają się z kilku różnych podjednostek odpowiedzialnych za rozpoznawanie i cięcie sekwencji DNA. Enzymy te wykorzystują GTP i dwuwartościowy magnez jako kofaktory.

Specyficzne miejsca cięcia obejmują nici nukleotydowe z metylowanymi lub hydroksymetylowanymi resztami cytozyny na jednej lub obu niciach kwasów nukleinowych.

Enzymy restrykcyjne typu V.

Ta klasyfikacja grupuje enzymy typu CRISPER-Cas, które identyfikują i wycinają określone sekwencje DNA z atakujących organizmów. Enzymy Cas wykorzystują nić zsyntetyzowanego RNA przewodnika CRISPER do rozpoznawania i atakowania atakujących organizmów.

Enzymy zaliczane do typu V to polipeptydy zbudowane według enzymów typu I, II i II. Potrafią wycinać odcinki DNA prawie każdego organizmu i mieć szeroki zakres długości. Ich elastyczność i łatwość użycia sprawiają, że enzymy te są obecnie, obok enzymów typu II, jednym z najczęściej używanych narzędzi w inżynierii genetycznej.

Przykłady

Enzymy restrykcyjne zostały wykorzystane do wykrywania polimorfizmów DNA, zwłaszcza w badaniach genetyki populacji i badaniach ewolucyjnych z wykorzystaniem mitochondrialnego DNA, w celu uzyskania informacji o szybkości podstawień nukleotydów.

Obecnie wektory używane do transformacji bakterii do różnych celów posiadają miejsca wieloklonowania, w których znajdują się miejsca rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych.

Wśród tych enzymów najbardziej popularne są EcoRI, II, III, IV i V, otrzymane i opisane po raz pierwszy z E. coli; HindIII z H. influenzae i BamHI z B. amyloliquefaciens.

Bibliografia

1. Bickle, TA i Kruger, DH (1993). Biologia restrykcji DNA. Microbiological Reviews, 57 (2), 434–450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, DA i Horvath, P. (2007). CRISPR zapewnia nabytą odporność na wirusy u prokariotów. Science, 315 (marzec), 1709–1713.
3. Goodsell, D. (2002). Perspektywa molekularna: endonukleazy restrykcyjne. Stem Cells Fundamentals of Cancer Medicine, 20, 190–191.
4. Halford, SE (2001). Podskakiwanie, skakanie i zapętlanie przez enzymy restrykcyjne. Biochemical Society Transactions, 29, 363–373.
5. Jeltsch, A. (2003). Utrzymanie tożsamości gatunkowej i kontrola specjacji bakterii: nowa funkcja systemów restrykcji / modyfikacji? Gene, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E. i Kilpatrick, S. (2018). Genes Lewina XII (12 wyd.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N.,… She, Q. (2015). Wykorzystanie systemów CRISPR-Cas Typu I i Typu III do edycji genomu. Nucleic Acids Research, 1–12.
8. Loenen, WAM, Dryden, DTF, Raleigh, EA i Wilson, GG (2013). Enzymy restrykcyjne typu I i ich pokrewne. Nucleic Acids Research, 1–25.
9. Nathans, D. i Smith, HO (1975). Restrykcyjne endonukleazy w analizie i restrukturyzacji cząsteczek DNA. Annu. Rev. Biochem. , 273–293.
10. Nei, M., & Tajima, F. (1981). Polimorfizm DNA wykrywalny przez endonukleazy restrykcyjne. Genetyka, 145-163.
11. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. i Wende, W. (2005). Endonukleazy restrykcyjne typu II w naukach o życiu komórkowym i molekularnym: struktura i mechanizm. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685–707.
12. Roberts, R. (2005). Jak enzymy restrykcyjne stały się końmi pociągowymi biologii molekularnej. PNAS, 102 (17), 5905–5908.
13. Roberts, RJ i Murray, K. (1976). Endonukleazy restrykcyjne. Critical Reviews in Biochemistry, (listopad), 123-164.
14. Stoddard, BL (2005). Struktura i funkcja endonukleazy naprowadzającej. Kwartalne przeglądy biofizyki, 1–47.
15. Tock, MR i Dryden, DTF (2005). Biologia restrykcji i anty-restrykcji. Current Opinion in Microbiology, 8, 466–472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16. Wilson, GG i Murray, NE (1991). Systemy ograniczeń i modyfikacji. Annu. Rev. Genet. , 25, 585-627.
17. Wu, Z. i Mou, K. (2016). Wgląd genomowy w wirulencję Campylobacter jejuni i genetykę populacji. Infec. Dis. Tłum. Med., 2 (3), 109–119.
18. Yuan, R. (1981). Struktura i mechanizm wielofunkcyjnych endonukleaz restrykcyjnych. Annu. Rev. Biochem. , 50, 285-315.