WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA (HPLC): UZASADNIENIE, SPRZĘT, RODZAJE - CHEMIA - 2025

Wysokosprawna chromatografia cieczowa jest techniką instrumentalne stosowane w analizach chemicznych, które mogą rozdzielania mieszanin, oczyścić i określenie jego składniki, a dalsze badania. Jest znany pod skrótem HPLC, pochodzącym z angielskiego: High Performance Liquid Chromatography.

Tak więc, jak sama nazwa wskazuje, działa poprzez manipulowanie płynami. Składają się one z mieszaniny złożonej z badanego analitu lub próbki i jednego lub więcej rozpuszczalników, które działają jako faza ruchoma; to znaczy taki, który przeciąga analit przez cały sprzęt HPLC i kolumnę.

Sprzęt do HPLC. Źródło: Dqwyy

HPLC jest szeroko stosowana przez laboratoria analizy jakości w wielu firmach; takich jak farmaceutyki i żywność. Analityk, o którym mowa, musi przygotować próbkę, fazę ruchomą, sprawdzić temperaturę i inne parametry oraz umieścić fiolki w kole lub karuzeli, aby sprzęt automatycznie wykonywał wstrzyknięcia.

Sprzęt do HPLC jest sprzężony z komputerem, za pomocą którego można obserwować wygenerowane chromatogramy, a także w celu rozpoczęcia analiz, kontroli przepływu fazy ruchomej, zaprogramowania typu elucji (izokratycznej lub gradientowej) oraz włączenia detektorów (UV -Vis lub spektrofotometr mas).

Podstawa

W przeciwieństwie do konwencjonalnej chromatografii cieczowej, takiej jak chromatografia kolumnowa wypełniona papierem lub żelem krzemionkowym, HPLC nie zależy od grawitacji, aby ciecz zwilżała fazę stacjonarną. Zamiast tego współpracuje z pompami wysokociśnieniowymi, które nawadniają fazę ruchomą lub eluent przez kolumnę z większą intensywnością.

W ten sposób nie jest konieczne przesypywanie fazy ruchomej co jakiś czas przez kolumnę, ale raczej system robi to w sposób ciągły iz większymi prędkościami przepływu.

Ale skuteczność tej techniki nie wynika wyłącznie z tego szczegółu, ale także z drobnych cząstek wypełniacza, które tworzą fazę stacjonarną. Ponieważ jest mniejszy, jego powierzchnia styku z fazą ruchomą jest większa, więc będzie on lepiej oddziaływał z analitem, a jego cząsteczki będą się bardziej rozdzielać.

Te dwie cechy oraz fakt, że technika umożliwia sprzężenie detektorów, sprawiają, że HPLC znacznie przewyższa chromatografię cienkowarstwową lub papierową. Separacje są bardziej wydajne, faza ruchoma lepiej przechodzi przez fazę stacjonarną, a chromatogramy mogą wykryć wszelkie błędy w analizie.

Ekwipunek

Uproszczony schemat działania sprzętu HPLC. Źródło: Gabriel Bolívar.

Powyżej znajduje się uproszczony schemat działania sprzętu HPLC. Rozpuszczalniki znajdują się w odpowiednich pojemnikach, ułożonych wężami w taki sposób, że pompa pobiera ich niewielką ilość do urządzenia; mamy zatem fazę ruchomą.

Fazę ruchomą lub eluent należy najpierw odgazować w taki sposób, aby pęcherzyki nie wpływały na separację cząsteczek analitu, które są mieszane z fazą ruchomą po wykonaniu wstrzyknięć przez urządzenie.

Kolumna chromatograficzna jest umieszczona wewnątrz pieca, który umożliwia regulację temperatury. W związku z tym dla różnych próbek istnieją odpowiednie temperatury, aby osiągnąć wysoką wydajność rozdziału, a także szeroki katalog kolumn i rodzajów wypełnień lub faz stacjonarnych do specyficznej analizy.

Faza ruchoma z rozpuszczonym analitem wchodzi do kolumny, z której najpierw eluują się cząsteczki, które „czują” mniejsze powinowactwo do fazy stacjonarnej, natomiast te, które są przez nią bardziej zatrzymywane, eluują się później. Każda eluowana cząsteczka generuje sygnał wyświetlany na chromatogramie, na którym obserwuje się czasy retencji oddzielonych cząsteczek.

Z drugiej strony faza ruchoma po przejściu przez detektor trafia do pojemnika na odpady.

Typy HPLC

Istnieje wiele typów HPLC, ale spośród nich wszystkie wyróżniają się cztery następujące.

Chromatografia w normalnej fazie

Chromatografia w fazie normalnej odnosi się do takiej, w której faza stacjonarna ma charakter polarny, podczas gdy faza ruchoma jest niepolarna. Chociaż nazywa się to normalnym, w rzeczywistości jest najmniej używany, a faza odwrócona jest najbardziej rozpowszechniona i wydajna.

Chromatografia z odwróconymi fazami

Będąc fazą odwrotną, teraz faza stacjonarna jest niepolarna, a faza ruchoma jest biegunowa. Jest to szczególnie przydatne w analizie biochemicznej, ponieważ wiele biomolekuł lepiej rozpuszcza się w wodzie i polarnych rozpuszczalnikach.

Chromatografia jonowymienna

W tego typu chromatografii analit z ładunkiem dodatnim lub ujemnym przemieszcza się przez kolumnę, zastępując jony, które zawiera. Im wyższy ładunek, tym wyższa jego retencja, dlatego jest szeroko stosowany do separacji jonowych kompleksów metali przejściowych.

Chromatografia z wykluczaniem rozmiarów

Ta chromatografia, zamiast oddzielania, jest odpowiedzialna za oczyszczanie powstałej mieszaniny. Jak sama nazwa wskazuje, separacja analitu nie zależy już od tego, jak blisko jest on powiązany z fazą stacjonarną, ale od jego wielkości i mas cząsteczkowych.

Mniejsze cząsteczki będą bardziej zatrzymywane niż duże, ponieważ te ostatnie nie są uwięzione między porami wypełnienia kolumny polimerowej.

Aplikacje

HPLC umożliwia zarówno analizę jakościową, jak i ilościową. Pod względem jakościowym, porównując czasy retencji chromatogramu w określonych warunkach, można wykryć obecność określonego związku. Taka obecność może wskazywać na chorobę, zafałszowanie lub używanie narkotyków.

Dlatego jest częścią komputerową laboratoriów diagnostycznych. Podobnie występuje w przemyśle farmaceutycznym, gdyż pozwala na weryfikację czystości produktu, a także jego jakości pod kątem rozpuszczalności w środowisku żołądkowym. Materiały wyjściowe są również poddawane HPLC w celu ich oczyszczenia i zapewnienia lepszej wydajności w syntezie leków.

HPLC umożliwia analizę i separację złożonych mieszanin białek, aminokwasów, węglowodanów, lipidów, porfiryn, terpenoidów i jest zasadniczo doskonałą opcją do pracy z ekstraktami roślinnymi.

I wreszcie, chromatografia wykluczania molekularnego pozwala wybrać polimery o różnych rozmiarach, ponieważ niektóre mogą być mniejsze lub większe niż inne. W ten sposób uzyskuje się produkty o niskiej lub wysokiej średniej masie cząsteczkowej, co jest czynnikiem decydującym o ich właściwościach i przyszłych zastosowaniach lub syntezie.

Bibliografia

1. Day, R., & Underwood, A. (1989). Ilościowa chemia analityczna. (wyd. piąte). Sala PEARSON Prentice.
2. Bussi Juan. (2007). Wysokosprawna chromatografia cieczowa. . Odzyskany z: fing.edu.uy
3. Wikipedia. (2019). Wysokosprawna chromatografia cieczowa. Odzyskane z: en.wikipedia.org
4. Clark Jim. (2007). Wysokosprawna chromatografia cieczowa. Źródło: chemguide.co.uk
5. Matthew Barkovich. (05 grudnia 2019). Wysokosprawna chromatografia cieczowa. Chemistry LibreTexts. Odzyskane z: chem.libretexts.org
6. GP Thomas. (15 kwietnia 2013). Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) - metody, zalety i zastosowania. Odzyskany z: azom.com