SEKWENCJONOWANIE DNA: MAXAM-GILBERT, METODA I PRZYKŁADY - BIOLOGIA - 2025

Sekwencjonowanie DNA (kwas dezoksyrybonukleinowy) jest procedura w laboratoriach biologii molekularnej, która pozwala , aby znać kolejności nukleotydów w materiale genetycznym zainteresowania. Ponadto można również ujawnić sekwencjonowanie RNA (kwasu rybonukleinowego).

Ta technika była nieodzowna dla rozwoju nauk biologicznych. Ma również zastosowanie w innych dziedzinach wiedzy - na przykład diagnostyce medycznej i dochodzeniach kryminalistycznych.

Źródło: pixabay.com

Wcześniej sekwencjonowanie nici DNA było uważane za powolną i kosztowną czynność, która pozwoliła na identyfikację tylko kilku par zasad w oligonukleotydach.

Obecnie, przy wszystkich postępach w nauce, sekwencjonowanie DNA jest rutynową operacją w wielu laboratoriach na całym świecie dzięki prawie 50-letniemu wkładowi badań w tej dziedzinie. Jeśli chodzi o długość łańcucha, w bardzo krótkim czasie można zsekwencjonować do milionów par zasad.

Aby to zrobić, opracowano dziesiątki technik, które różnią się ceną i precyzją. W tym artykule opiszemy zarówno techniki klasyczne, jak i nowoczesne, z których każda ma swoje zalety i wady.

Do tej pory techniki sekwencjonowania pozwalają na uzyskanie sekwencji całych genomów, od małych prokariotów i drożdży po genom ludzki.

Struktura DNA

Aby zrozumieć metody i techniki stosowane do sekwencjonowania DNA, konieczne jest poznanie pewnych kluczowych aspektów struktury i składu cząsteczki.

DNA to biocząsteczka występująca we wszystkich żywych organizmach, od bakterii po duże zwierzęta wodne. Organelle - podobnie jak mitochondria i chloroplasty - mają wewnątrz kolistą cząsteczkę DNA. Nawet w przypadku niektórych wirusów znalezionym materiałem genetycznym jest DNA.

Strukturalnie DNA to zbiór nukleotydów. Każda z nich składa się z węglowodanu, zasady azotowej (A, T, C lub G) i grupy fosforanowej. Celem sekwencjonowania DNA jest ujawnienie kolejności, w jakiej cztery zasady azotowe znajdują się w sekwencji.

Historia

W połowie lat pięćdziesiątych XX wieku badacze Watson i Crick opisali strukturę DNA za pomocą technik chrystologicznych. Jednak żadnemu z tych badaczy nie udało się znaleźć sposobu na rozwikłanie tej sekwencji.

Choć istnieli pewni poprzednicy, najważniejszym wydarzeniem było stworzenie metody Sangera w 1977 roku. Ojciec metody Frederick Sanger był brytyjskim biochemikiem, zdobywcą dwóch nagród Nobla za ogromny wkład w nauki biologiczne.

Ta technika jest również znana w literaturze jako „zakończenie łańcucha” lub dideoksynukleotydy. Zasady tej techniki oraz te, które zostały opracowane w oparciu o jej ulepszenia i innowacje zostaną opisane poniżej.

Metoda Sangera

Rozwój metody Sangera był ważnym wydarzeniem w biologii molekularnej. Obejmuje podstawowe składniki procesu replikacji DNA, który normalnie zachodzi w komórce, ale z dodatkiem specjalnego składnika: dideoksynukleotydów.

Główne składniki reakcji

- Polimeraza DNA: enzym polimeraza DNA jest kluczowym elementem procesu. Cząsteczka ta uczestniczy w replikacji nici DNA, a jej rolą jest synteza nowej nici, łącząc trójfosforanowe deoksyrybonukleotydy z komplementarnymi.

Przypomnijmy, że w DNA tyminy (T) łączą się z adeninami (A) poprzez dwa wiązania wodorowe, podczas gdy cytozyna (C) łączy się z guaniną (G) przez trzy wiązania.

- Nukleotydy: Sekwencjonowanie Sangera obejmuje dwa typy nukleotydów, cztery 2'-deoksynukleotydy (w skrócie dATP, dGTP, dCTP i dTTP) oraz cztery dideoksynukleotydy (ddATP, ddGTP, ddCTP i ddTTP).

Chociaż dideoksynukleotydy są podobne do monomerów, które są normalnie włączane do DNA, nie mają w swojej strukturze grupy -OH. Uniemożliwia to dodanie nowego nukleotydu do łańcucha.

Dlatego też, kiedy do tworzonego łańcucha dodawany jest specjalny nukleotyd - w sposób całkowicie przypadkowy - synteza jest sparaliżowana. Tak więc pod koniec reakcji występują łańcuchy o różnych rozmiarach, z których każdy został zatrzymany w innym punkcie.

Eksperymentalnie przygotowano cztery testy. Każdy zawiera DNA wyekstrahowane z interesującej próbki biologicznej, normalne nukleotydy i jeden z czterech specjalnych typów nukleotydów. Albo specjalne nukleotydy są zaznaczone jakimś rodzajem markera fluorescencyjnego (patrz automatyczne sekwencjonowanie poniżej).

Czytanie wyników

Pierwszym krokiem jest oddzielenie każdego z syntetyzowanych łańcuchów według ich rozmiaru. Niektóre będą dłuższe niż inne, w zależności od tego, gdzie zostały zastosowane specjalne bazy.

Istnieją różne techniki biochemiczne, które pozwalają na rozdzielenie składników mieszaniny na podstawie wielkości jako właściwości odróżniającej. W metodzie Sangera poszczególne łańcuchy rozdziela się metodą elektroforezy. W bardziej wyrafinowanych wariantach techniki stosuje się elektroforezę kapilarną.

Dlatego dłuższe pasma poruszają się mniej niż krótsze warianty. System ten następnie przechodzi przez czytnik, który rozpoznaje marker zawarty w każdym dideoksynukleotydzie. W ten sposób można poznać kolejność sekwencji.

Ta technika „pierwszej generacji” jest w stanie odczytać fragmenty DNA nie większe niż 1 kilobazę. Obecnie metoda Sangera stosowana jest w różnych laboratoriach, generalnie w jej nowoczesnych odmianach. Ponadto służy do potwierdzania wyników uzyskanych za pomocą najbardziej złożonych technik - ale mniej precyzyjnych.

Automatyczne sekwencjonowanie

Gdy sekwencjonowanie jest wymagane na dużą skalę, proces jest przyspieszany dzięki automatyzacji. Jest to odmiana metody terminacji łańcucha Sangera, w której startery są znakowane produktami fluorescencyjnymi w celu ich rozróżnienia.

Następnie produkt reakcji poddaje się elektroforezie - wszystko na jednym torze. Ponieważ każdy fragment opuszcza ostatnią część żelu, jest szybko identyfikowany poprzez znakowanie fluorescencyjne, z błędem około 1%.

Najbardziej wyrafinowane systemy mają system do 96 rurek kapilarnych zarządzanych przez komputer połączony z robotem. Oznacza to, że jednocześnie można badać 96 próbek DNA. Dzięki temu proces obejmujący elektroforezę i analizę wyników jest w pełni zautomatyzowany.

W ciągu jednego dnia systemy te mogą sekwencjonować do 550 000 zasad. W trakcie tego procesu praca ludzka jest zbędna, uruchomienie metody zajmuje tylko około 15 minut.

Sekwencjonowanie Maxama-Gilberta

W tym samym czasie, gdy Sanger opublikował swoją pracę, dwóm badaczom, imieniem Allan Maxan i Walter Gilbert, udało się opracować inną metodę uzyskiwania sekwencji DNA. Metoda zyskała wówczas popularność, ale później została wyparta przez udoskonalenie metody Sangera.

W przeciwieństwie do metody Sangera, sekwencjonowanie Maxana i Gilberta (lub sekwencjonowanie chemiczne, jak jest również znane) nie obejmuje reakcji hybrydyzacji. Metodologia polega na znakowaniu z jednej strony czynnikami reaktywnymi, a następnie na procesie oczyszczania.

Jednym z negatywnych aspektów tej techniki jest jej olbrzymia złożoność oraz stosowanie niebezpiecznych dla użytkownika chemikaliów. Przerwy chemiczne wywoływane są przez zastosowanie DMS, kwasu mrówkowego, hydrazyny i hydrazyny z solami.

Proces

Protokół rozpoczyna się od znakowania na końcu 5 'nici markerem 32 fosforu, po czym następuje chemiczna modyfikacja zasady azotowej i jest ona oddzielana. W końcu następuje rozszczepienie regionu bezzasadowego.

Najpierw skracasz ciąg, który chcesz sekwencjonować, na mniejsze segmenty. Ten krok jest wykonywany z enzymami restrykcyjnymi, które powodują wystające końce.

Następnie prowadzi się reakcję z alkaliczną fosfatazą, której celem jest wyeliminowanie grupy fosforanowej. Zatem do znakowania można zastosować kinazę polinukleotydową.

Łańcuszek jest zdenaturowany (dwie nici otwarte). Następnie nakładane są środki chemiczne. Te reakcje rozszczepienia są przeprowadzane w sposób kontrolowany i wiadomo, jakie rodzaje wiązań każde zastosowane chemiczne pęknięcie.

Czytanie wyników

Podobnie jak w metodzie Sangera, odczyt wyników obejmuje rozdział według rozmiaru łańcuchów uzyskanych w systemie elektroforezy. Systemy złożone z poliakryloamidu pozwalają na uzyskanie bardzo odpowiedniej rozdzielczości do odczytu żelu.

Masowe sekwencjonowanie

Masowe sekwencjonowanie obejmuje serię nowatorskich metod, w skrócie NGS, z angielskiego „Next Generation Sequencing”.

Metody sklasyfikowane jako NGS wymagają wcześniejszego etapu amplifikacji DNA (nie działają z pojedynczą cząsteczką). Ponadto używane platformy są bardzo zróżnicowane. Zasady najpopularniejszych metod zostaną opisane poniżej:

Pyrosequencing

Polega na monitorowaniu uwalniania pirofosforanu, które następuje za każdym razem, gdy do nici DNA dodaje się nowy nukleotyd. Układ enzymów jest sprzężony tak, że emisja światła (wykrywalnego przez kamerę) następuje za każdym razem, gdy włączany jest nowy nukleotyd.

Proces rozpoczyna się od oddzielnej inkubacji każdej zasady azotowej w celu sprawdzenia, czy występuje emisja światła. Pirosekwencjonowanie może odczytywać długie pasma, ale znaleziony współczynnik błędów jest wysoki.

Sekwencjonowanie syntezy

Obejmuje to włączenie wyznakowanych nukleotydów. Te składniki fluorescencyjne są dodawane, przemywane i odnotowywany jest wprowadzony nukleotyd. Następnie znacznik nukleotydowy jest usuwany, a synteza nici może być kontynuowana. W następnym kroku zostanie również włączony wyznakowany nukleotyd, a powyższe kroki zostaną powtórzone.

Wadą tej techniki jest sytuacja, gdy znaczniki fluorescencyjne nie są całkowicie usunięte. Te emisje powodują błędy w tle, powodując poważne błędy.

Sekwencjonowanie ligacji

Ta technika różni się od innych, ponieważ nie wykorzystuje polimerazy DNA. Zamiast tego kluczowym enzymem stosowanym w tej metodologii jest ligaza. Tutaj stosowane są fragmenty DNA znakowane fluorescencyjnie, jest ono łączone przez enzym i jest wykrywane.

Największym problemem związanym z tą techniką jest krótka długość fragmentu, którą jest w stanie przetworzyć.

Ion Torrent Sequencing

Technika ta opiera się na pomiarze jonu H ^+, który jest uwalniany za każdym razem, gdy wprowadzany jest nowy nukleotyd. Zasada jest dość podobna do pirosekwencjonowania, ale znacznie tańsza.

Przykłady

Sekwencjonowanie ludzkiego genomu

Sekwencjonowanie ludzkiego genomu jest jednym z najbardziej obiecujących wyzwań w biologii, a także jedną z najbardziej uznanych rywalizacji w historii nauki. W rzeczywistości dla naukowców zaangażowanych w projekt sekwencjonowanie genomu stało się konkurencją.

W 1990 roku rozpoczął tak zwany „projekt ludzkiego genomu”, prowadzony przez słynnego naukowca, laureata Nagrody Nobla, Jamesa Watsona. Po roku, w 1991 roku, Venter podejmuje wyzwanie „pokonania” Watsona i sekwencjonowania genomu przed nim. Jednak w 1992 roku Watson przeszedł na emeryturę, a dowództwo przejął inny badacz.

W 1995 Venter ogłosił swój sukces w całkowitym sekwencjonowaniu genomu bakteryjnego metodą sekwencjonowania losowego. Podobnie, drużyna przeciwna rok później ogłosiła sekwencjonowanie genomu drożdży.

W 2000 roku dyplom został zakończony. Obie firmy opublikowały wstępne wyniki całego genomu w dwóch najbardziej prestiżowych czasopismach naukowych: Nature i Science.

Jednak naukowcy kontynuowali prace nad udoskonaleniem propozycji iw 2006 r. Ukończono sekwencje niektórych ludzkich chromosomów.

Znaczenie i zastosowania

Znajomość kolejności nukleotydów tak ważnej cząsteczki jak DNA jest cenna dla biologów i pokrewnych im specjalistów. Ten łańcuch polinukleotydów zawiera wszystkie informacje niezbędne do rozwoju i utrzymania wszystkich form życia.

Z tych powodów znajomość tej sekwencji jest niezbędna do badań biologicznych. Zasadniczo sekwencjonowanie pozwala zmierzyć jedną z najważniejszych właściwości układów biologicznych i ustalić różnice między nimi.

Sekwencjonowanie jest szeroko stosowane przez taksonomów i systematyków, ponieważ niektóre sekwencje DNA umożliwiają ustalenie kryteriów pozwalających stwierdzić, czy dwa organizmy należą do tego samego gatunku, a także są w stanie zaproponować hipotezy dotyczące zależności filogenetycznych między nimi.

Ponadto sekwencjonowanie DNA ma zastosowanie w medycynie i diagnostyce. Na przykład istnieją niedrogie i dostępne systemy, które dzięki sekwencjonowaniu umożliwiają ocenę tendencji do rozwoju niektórych chorób (np. Raka) przy użyciu tzw. Polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP).

Dochodzenia typu kryminalnego i kryminalistycznego wzbogacono również o techniki sekwencjonowania, które mogą posłużyć jako miarodajny dowód udziału danej osoby w przestępstwie.

Bibliografia

1. Heather, JM i Chain, B. (2016). Sekwencja sekwencerów: historia sekwencjonowania DNA. Genomics, 107 (1), 1-8.
2. Koboldt, DC, Steinberg, KM, Larson, DE, Wilson, RK i Mardis, ER (2013). Rewolucja w sekwencjonowaniu nowej generacji i jej wpływ na genomikę. Celi, 155 (1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Rywalizacje naukowe. Od Galileo do projektu ludzkiego genomu. Redakcja Paraninfo.
4. Sanger, F., Nicklen, S. i Coulson, AR (1977). Sekwencjonowanie DNA z inhibitorami kończącymi łańcuch. Materiały Krajowej Akademii Nauk, 74 (12), 5463-5467.
5. Schuster, SC (2007). Sekwencjonowanie nowej generacji zmienia dzisiejszą biologię. Metody natury, 5 (1), 16.
6. Xu, J. (red.). (2014). Sekwencjonowanie nowej generacji. Caister Academic Press.