TEST OKSYDAZY: UZASADNIENIE, PROCEDURA I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Test oksydazy jest metodą diagnostyczną, która wykazuje obecność kompleksu enzymatycznego zwanego oksydazą cytochromową c. System ten indukuje przemianę zredukowanego cytochromu do utlenionego, ponieważ wychwytuje on tlen, a ten z kolei działa jako ostatni akceptor elektronów (H ⁺ ) w łańcuchu oddechowym.

Termin oksydaza jest skrótowym określeniem enzymu oksydazy cytochromu, znanego również jako oksydaza indofenolowa. W starożytności uważano, że enzymy oksydaza cytochromowa i oksydaza indofenolowa to dwa różne enzymy, ale dziś wiadomo, że są tym samym.

Pozytywny i negatywny test oksydazy. Źródło: nie podano autora do odczytu maszynowego. Założono, że Alpha.prim ~ commonswiki (na podstawie roszczeń dotyczących praw autorskich).

Ze swojej strony cytochromy są hemoproteinami zawierającymi żelazo i uzupełniającymi układ oksydazy cytochromowej. Cytochromy mogą się różnić w zależności od gatunku.

Istnieją różne odmiany cytochromów (cytochromy a1, a2, a3 i 0). Niektóre bakterie mogą produkować tylko jedną, a inne do dwóch lub trzech naraz. W tym sensie obecność cytochromu a i a3 jest znana jako oksydaza cytochromu c. Jest to rodzaj cytochromu wykrywany przez test oksydazy.

Rodzaje Neisseria i Pseudomonas zawierają oksydazę cytochromową c. Te rodzaje dają pozytywny wynik testu oksydazowego, pomagając odróżnić je odpowiednio od rodzajów Acinetobacter i Stenotrophomonas.

Istnieją również inne rodzaje oksydazododatnie.

Podstawa

Charakterystyka układu oksydazy cytochromowej c

Układ oksydazy cytochromu c działa w następujący sposób: mikroorganizmy dodatnie pod względem oksydazy wykorzystują tlen do generowania energii poprzez oddychanie tlenowe. System ten działa dzięki transportowi elektronów z substancji dawców, takich jak NADH ^+, do substancji receptorowych, w tym przypadku tlenu.

Powoduje to produkcję energii (ATP) i wody lub nadtlenku wodoru, w zależności od układu oksydazy cytochromowej, który posiada mikroorganizm.

Z tego powodu większość bakterii oksydazododatnich jest również katalazododatnich, co jest warunkiem koniecznym do wyeliminowania wytwarzanego nadtlenku wodoru, ponieważ ta substancja jest toksyczna dla bakterii.

Układ oksydazy cytochromowej c występuje w niektórych bakteriach tlenowych, niektórych fakultatywnych beztlenowcach, nielicznych mikroaerofilnych i nie ma ścisłych beztlenowców. To ostatnie jest zrozumiałe, ponieważ bezwzględne beztlenowce nie mogą żyć w obecności tlenu, dlatego brakuje im układu oksydazy cytochromowej.

Zasada testu

W tym teście wykorzystuje substancje, które działają jako sztuczne akceptory elektronów, zastępując naturalne w łańcuchu transportu elektronów.

Stosowane są głównie barwniki, takie jak parafenylenodiamina i indofenol, które działają jako substraty receptorów i sztuczne donory elektronów.

Parafenylenodiamina jest utleniana przez układ oksydazy cytochromowej c. Barwnik w postaci zredukowanej jest bezbarwny, ale w postaci utlenionej jest zabarwiony.

W ten sposób udowadnia się obecność układu oksydazy cytochromowej c; ponieważ pozytywna reakcja da kolor lawendowy lub niebiesko-fioletowy w zależności od użytego odczynnika.

Z drugiej strony, jeśli ostatnia substancja akceptująca elektrony w łańcuchu oddechowym różni się od tlenu, test oksydazy będzie ujemny (nie będzie wytwarzać koloru); tak jest w przypadku mikroorganizmów beztlenowych.

Podobnie, jeśli cytochrom używany przez drobnoustrój różni się od cytochromu oksydazy c, również da wynik ujemny.

Proces

Istnieją różne odczynniki i protokoły testu oksydazy, wszystkie w tym samym celu.

Odczynniki

Odczynnik Kovacsa, odczynnik Gordona i McLeoda, odczynnik Nadi, odczynnik Carpentera, Suhrlanda i Morrisona oraz użycie krążków oksydazy.

-Odczynnik oksydazy Kovacsa

Składa się z 1% dichlorowodorku tetrametylo-p-fenylenodiaminy.

Odczynnik Kovacsa przygotowuje się rozpuszczając 1 g w / w substancji w 50 ml wody destylowanej. Jest subtelnie podgrzewany, aż do całkowitego rozpuszczenia. Przenieść do bursztynowej butelki o odpowiedniej pojemności i dopełnić do 100 ml wodą destylowaną. Odczekaj co najmniej 15 minut przed użyciem. Przechowywać w lodówce, chronić przed światłem.

Jest oznaczony odczynnikiem oksydazy Kovacsa, aby odróżnić go od odczynnika Kovacsa używanego do ujawnienia testu indolowego. Ten odczynnik jest najbardziej czuły, mniej toksyczny, ale droższy niż pozostałe odczynniki.

Pozytywna reakcja będzie wykazana w przypadku tego odczynnika ze zmianą koloru kolonii na lawendową, która szybko zmienia kolor na fioletowy, prawie czarny. Negatywna reakcja jest widoczna, ponieważ kolonia nie zmienia koloru lub przybiera lekko różowawy kolor. Pożywka może również ciemnieć, ale nie oznacza to pozytywnej reakcji.

W przypadku tego odczynnika czas reakcji ma kluczowe znaczenie, a zmiana koloru, która występuje między 5 a 15 sekundami, jest uważana za reakcję pozytywną.

- Odczynnik Gordona i McLeoda

Składa się z dichlorowodorku dimetylo-p-fenylenodiaminy, znanego również jako N-dimetylo-p-fenylenodiamina lub monochlorowodorek p-aminodimetyloaniliny. Przygotowuje się go zgodnie z opisem dla odczynnika oksydazy Kovacsa, zastępując substancję, której dotyczy.

Odczynnik ten jest nieco bardziej stabilny niż odczynnik oksydazy Kovacsa, chociaż wszystkie odczynniki zawierające p-fenylenodiaminę są niestabilne.

Ta reakcja jest późniejsza, jest interpretowana jako pozytywna z pojawieniem się niebiesko-fioletowego koloru w ciągu 10 do 30 minut.

- Odczynnik Nadi

Składa się z 1% α-naftolu w alkoholu etylowym (95% etanolu) i 1% aminodimetyloaniliny. Mieszaninę przygotowuje się w równych częściach, używając absolutnego alkoholu etylowego jako rozcieńczalnika, aż do uzyskania wystarczającej ilości na 100 ml.

-Carpenter, Suhrland i Morrison odczynnik

Składa się z 1% szczawianu p-aminodimetyloalaniny. Przygotować w taki sam sposób, jak opisano dla odczynnika oksydazy Kovacsa, zmieniając na odpowiednią substancję.

Gdy roztwór jest gotowy, paski testowe przygotowuje się w następujący sposób: 6-8 cm paski bibuły filtracyjnej Whatman nr 1 impregnuje się 1% odczynnikiem szczawianu dimetylo-p-fenylenodiaminy.

Można je wysuszyć bez kontaktu z metalem, przechowywać w zakręcanych słoikach ze środkiem osuszającym i przechowywać w lodówce. Te paski są stabilne do 6 miesięcy.

Jest to najbardziej stabilny odczynnik spośród wszystkich wymienionych i może trwać do 6 miesięcy w roztworze. Kolejną zaletą jest to, że nie zabarwia podłoża wokół kolonii, jeśli jest stosowany bezpośrednio na płytce.

Pojawienie się koloru czerwonego jest interpretowane jako wynik pozytywny.

-Płyty z oksydazą

Są to dostępne w handlu krążki, które są impregnowane odczynnikiem do testu oksydazy. Na rynku jest kilka marek handlowych.

Jego użycie jest dość praktyczne, ponieważ nie ma konieczności przygotowywania świeżych odczynników, co ułatwia pracę. Uzyskane wyniki są wiarygodne, o ile dyski są odpowiednio konserwowane.

Protokoły

Metoda bezpośrednia płytkowa, metoda pośrednia na papierze oraz użycie krążków impregnowanych odczynnikami oksydazy.

-Bezpośrednia metoda tablicy

W tym celu dodaje się 2 lub 3 krople któregokolwiek z wyżej wymienionych odczynników bezpośrednio na kolonię (kolonie) zawartą na płytce pożywki hodowlanej, która nie zawiera glukozy.

Interpretowana jest zmiana lub brak koloru kolonii, a nie pożywka. Właściwy czas reakcji zależy od użytego odczynnika.

-Metoda pośrednia na papierze

Wytnij kawałek bibuły filtracyjnej (Whatman nr 1) do rozmiaru 6 cm ² i umieść go w pustej szalce Petriego.

Dodaj 2 lub 3 krople odczynnika oksydazy Kovacsa na papier, weź część kolonii do badania platynową rączką lub drewnianą wykałaczką i rozprowadź ją w linii prostej na papierze impregnowanym odczynnikiem. Interpretacja w ciągu 5 do 10 sekund.

Po przygotowaniu pasków z odczynnikiem Carpentera, Suhrlanda i Morrisona na suchy pasek rozprowadza się kolonię. Pojedynczy pasek służy do testowania kilku szczepów. Tłumaczenie w 10 sek.

-Dyski (m

Delikatnie zwilż dostępne w handlu krążki sterylną wodą destylowaną i nałóż na badaną kolonię. Zaleca się używanie płytek w temperaturze 35 ° C, jeśli używane są płytki w temperaturze pokojowej lub płytki chłodzone, reakcja przebiega nieco wolniej. Zinterpretuj zmianę koloru między 10 a 20 sekund.

Można zastosować kolonie zawarte na agarze z krwią lub czekoladą.

-Dyski (metoda pośrednia)

Zwilżyć dysk zgodnie z wcześniejszym opisem. Umieść go na pustej szalce Petriego. Weź wystarczającą ilość kolonii do badania platynową rączką lub drewnianą wykałaczką i umieść na dysku. Zinterpretuj zmianę koloru między 10 a 20 sekund.

Posługiwać się

Rodzaj Neisseria i Acinetobacter są czasami bardzo podobne pod względem morfologicznym, ponieważ chociaż rodzaj Acinetobacter jest pałeczką Gram-ujemną, może czasami przybierać formę kokkoidy i być rozprowadzany parami, naśladując rodzaj Neisseria.

W tym przypadku test oksydazy jest naprawdę przydatny. Rodzaj Neisseria jest pozytywny, a Acinetobacter negatywny.

Jednak rodzaj Moraxella jest bardzo podobny do rodzaju Neisseria i oba dają pozytywną reakcję; Dlatego w celu ostatecznej identyfikacji należy zawsze przeprowadzić testy fermentacji węglowodanów.

Z drugiej strony test oksydazy jest przydatny do różnicowania bakterii należącej do rodziny Enterobacteriaceae (wszystkie oksydazo-ujemne) od innych fermentatorów, takich jak rodzaj Pasteurella, Aeromonas, Plesiomonas (oksydazododatnia).

Rodzaje Vibrio i Helicobacter są również oksydazo-dodatnie.

QA

Użyć znanych szczepów Escherichia coli jako kontroli negatywnej i szczepów Pseudomonas aeruginosa jako kontroli pozytywnej.

Ograniczenia

-Odczynniki muszą być używane świeżo przygotowane, ich okres przechowywania w roztworze w temperaturze pokojowej jest krótki, ponieważ są bardzo niestabilne. W lodówce mogą trwać od 5 dni do 2 tygodni.

- Odczynniki są bezbarwne, jeśli zmieniają kolor, należy je wyrzucić. Uszkodzone dyski pojawiają się, ponieważ z czasem ciemnieją.

-Dodatnia reakcja z odczynnikiem oksydazy Kovacsa między 15 a 60 sekundami jest uważana za reakcję opóźnioną i po 60 sekundach powinna być uważana za negatywną.

-Haemophylus influenzae daje ujemną reakcję oksydazy, jeśli używany jest jakikolwiek odczynnik z dimetylo-p-fenylenodiaminą, ale dodatnią, jeśli używany jest odczynnik oksydazy Kovacsa (tetrametylo-p-fenylenodiamina).

-Środki zawierające glukozę zakłócają test, dając fałszywie ujemne wyniki.

- Szczepy Bordetella pertussis mogą dawać fałszywie dodatnią reakcję, jeśli pochodzą z wysoko stężonych płytek agarowych z krwią.

-Użycie metalowych (żelaznych) uchwytów daje fałszywie dodatnią reakcję.

zalecenia

-Ponieważ odczynniki są bardzo niestabilne i mają tendencję do samoutleniania, zaleca się zamrażanie porcji od 1 do 2 ml i usuwanie w razie potrzeby.

-Innym sposobem na opóźnienie samoutleniania odczynnika jest dodanie 0,1% kwasu askorbinowego podczas przygotowywania odczynników.

- Ponieważ odczynniki są niestabilne, zaleca się cotygodniową kontrolę jakości.

- Nie należy używać odczynników, które nie przejdą testu kontroli jakości.

Bibliografia

1. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
3. „Test oksydazy”. Wikipedia, wolna encyklopedia. 15 stycznia 2018 r., 10:32 UTC. 3 kwietnia 2019, 14:03
4. Światowa Organizacja Zdrowia. Laboratory Manual for the Identification and Testing of Susceptibility to Antimicrobials of Bacterial Pathogens of Bacterial Pathogens of Public Health Znaczenie in the Developing World.2004. Dostępne pod adresem: who.int/drugresistance/infosharing
5. Paski odczynnikowe do diagnostyki aktywności oksydazy u bakterii. Rev Cubana Med Trop. 2000; 52 (2): 150-151.