TEST VOGES-PROSKAUER: PODSTAWA, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2025

Test Voges-Proskauer jest testem biochemicznym stosowanym jako pomoc w identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Jest szczególnie przydatny do różnicowania między innymi szczepów Escherichia coli od Klebsiella i Enterobacter.

Test przeprowadza się w płynnej pożywce hodowlanej o nazwie Methyl Red - Voges Proskauer, lepiej znanej pod akronimem RM / VP. Podłoże to składa się z buforowanego polipeptonu, glukozy, fosforanu dipotasowego i wody destylowanej.

Methyl Red-Voges Proskauer (RM / VP) komercyjne podłoże / test VP odpowiednio dodatni i ujemny. Źródło: Zdjęcie autorstwa mgr inż. Marielsa Gil / Sudipta.nov15, źródło Wikimedia Commons

Obecna pożywka RM / VP jest modyfikacją pożywki Clarka i Lubsa, która pierwotnie zawierała niższe stężenie peptonów i glukozy. W ten sposób wytworzono mniej jonów wodorowych, potrzebnych do dodatniej reakcji Vogesa-Proskauera.

Test opiera się na zdolności mikroorganizmu do wykorzystania glukozy na drodze glikolu butylenowego i utworzenia obojętnego produktu końcowego zwanego acetoiną, w obecności tlenu i zasadowego pH.

W pożywce RM / VP, oprócz możliwości ujawnienia testu Voges-Proskauer, można również ujawnić test czerwieni metylowej.

Podstawa

Podstawa testu Voges-Proskauer

Pluripeptones obecne w pożywce zapewniają podstawowe wymagania żywieniowe dla wzrostu bakterii. Z kolei glukoza jest głównym związkiem. Wiele bakterii ma zdolność metabolizowania glukozy i tworzenia kwasu pirogronowego.

Kwas pirogronowy jest punktem środkowym w metabolizmie glukozy i stamtąd każdy mikroorganizm może obrać inną drogę. Niektóre będą tworzyć kwasy mieszane, takie jak kwas mlekowy, kwas octowy, kwas mrówkowy i kwas bursztynowy, a inne będą tworzyć obojętne produkty, takie jak 2,3-butanodiol.

Test Voges-Proskauer ujawnia zdolność mikroorganizmu do tworzenia acetylometylokarbinolu (acetoiny), produktu pośredniego 2,3-butanodiolu w warunkach tlenowych.

Acetoina ulega redukcji i tworzy 2,3-butanodiol, ale ta reakcja jest odwracalna, więc jeśli 2,3-butanodiol jest utleniany, powstaje acetoina. Dlatego tlen jest niezbędny.

Fosforan dipotasowy jest buforem buforującym mieszaninę przy pH 6,9 ± 0,2.

Podstawy ujawniania i interpretacji dowodów

Aby zademonstrować reakcję, wywołanie należy przeprowadzić przy użyciu dwóch odczynników (odczynników Barrita), znanych jako Voges A i Voges B.

Voges A to 5% roztwór α-naftolu, a Voges B to 40% preparat wodorotlenku potasu. Jeśli wodorotlenek potasu nie jest dostępny, można go zastąpić 40% wodorotlenkiem sodu.

Α-Naftol jest katalizatorem, który zwiększa intensywność koloru reakcji, zwiększając czułość testu. Najpierw należy zawsze dodać α-naftol, potrząsając rurką, aby medium zetknęło się z tlenem. W ten sposób obecna acetoina jest utleniana do diacetylu, a 2,3-butanodiol jest utleniany do acetoiny, przechodząc do diacetylu.

W ten sposób α-naftol będzie wiązał się z diacetylem, który z kolei dołączył do jądra guanidyny obecnego w aminokwasie argininie, który pochodzi z pluripeptonów.

Z kolei wodorotlenek potasu lub sodu jest odpowiedzialny za wchłanianie CO ₂ i reagowanie z peptonami. Ta reakcja powoduje powstanie łososiowo-różowego koloru, wyraźnie widocznego po bardzo mocnym wstrząśnięciu probówki.

Prawidłowe ilości diacetylu, peptonu i α-naftolu muszą być zmieszane, aby kolor pojawił się natychmiast. Jeśli tak się nie stanie, zgłębnik powinien odpocząć przez 15 minut przed tłumaczeniem.

Wynik testu jest zwykle pozytywny po 2 do 5 minutach, kiedy można zobaczyć blady różowy kolor. Po odstawieniu na 30 minut do 1 godziny intensywność koloru będzie maksymalna (intensywna czerwień).

Negatywny wynik testu pojawi się, gdy bulion zmieni kolor na żółty. Po 1 godzinie, jeśli wynik testu jest negatywny, w wyniku reakcji wodorotlenku potasu z α-naftolem może powstać zabarwienie miedzi.

Przygotowanie

Średni MR / VP

Odważyć 17 g odwodnionej pożywki hodowlanej i rozpuścić w litrze wody destylowanej. Odstaw na 5 minut. Podgrzej do wrzenia, aby całkowicie się rozpuścił. Podawać od 3 do 4 ml w probówkach i sterylizować w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut.

Odwodniona pożywka hodowlana jest koloru beżowego, a przygotowana pożywka ma kolor jasnobursztynowy.

Końcowe pH pożywki wynosi 6,9 ± 0,2.

Odczynnik Voges A.

Odważyć 5 g α-naftolu i rozpuścić w 50 ml alkoholu etylowego (absolutnego). Następnie kontynuuj dodawanie alkoholu etylowego, aż osiągnie 100 ml.

Odczynnik Voges B.

Odważyć 40 g wodorotlenku potasu i rozpuścić w zlewce w 50 ml wody destylowanej. Szklankę należy umieścić w zimnej łaźni wodnej, aby kontrolować temperaturę, ponieważ po rozpuszczeniu preparatu temperatura gwałtownie rośnie.

Po ostygnięciu roztworu przenosi się go do kolby miarowej i uzupełnia do 100 ml wodą destylowaną.

Procedura testowa Voges-Proskauer

W celu wykonania testu Voges-Proskauer, bulion RM / VP jest zaszczepiany badanym mikroorganizmem z czystej kultury przez 18 do 24 godzin.

Inokulum nie powinno być bardzo gęste. Inkubuje się go w temperaturze 35–37 ° C przez 24–48 godzin, chociaż czasami konieczna jest inkubacja przez kilka dni. Cowan i Steel uważają, że 5 dni to minimalny czas inkubacji niezbędny do wykrycia wszystkich pozytywnych gatunków Voges-Proskauer (VP) z rodziny Enterobacteriaceae.

Rozwój testów

Oddzielić 1 ml podwielokrotność do probówki i rozwinąć w następujący sposób: Umieścić 12 kropli (0,6 ml) odczynnika Voges A i 4 krople (0,2 ml) Voges B. Wymieszać do napowietrzenia i pozostawić do osadzenia na 5 - 10 minut przed tłumaczeniem. Jeśli jednak wynik testu jest nadal negatywny, należy odstawić go i obserwować probówkę po 30 minutach do 1 godziny.

Pojawienie się różowawo-czerwonego koloru wskazuje, że reakcja Vogesa-Proskauera jest pozytywna. Jeśli pożywka pozostaje żółta, reakcja jest negatywna.

Dodawanie programistów w podanej kolejności i ilości jest niezbędne, aby uniknąć fałszywych wyników negatywnych.

Posługiwać się

Test Voges-Proskauer jest przydatny do rozróżnienia między szczepami E. coli, które są VP ujemne, między innymi z rodzaju Klebsiella, Enterobacter, Serratia, które są VP pozytywne.

Źródło: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.

QA

Do badania jakości przygotowanej pożywki można zastosować szczepy kontrolne, w tym Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium i Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Oczekiwane wyniki to pozytywne reakcje Voges-Proskauer tylko dla K. pneumoniae i E. cloacae. Reszta daje negatywne reakcje.

Bibliografia

1. Britannia Laboratories. MR-VP Medium. 2015 Dostępne pod adresem: www.britanialab.com
2. Laboratoria Microkit. M-Ident Voges Proskauer. 2014. Dostępny: http://www.medioscultivo.com
3. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne do identyfikacji bakterii o znaczeniu klinicznym. 3rd ed. Od redakcji Panamericana. Buenos Aires. Argentyna.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.