BARWIENIE ZARODNIKÓW: UZASADNIENIE, TECHNIKI I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Barwienie zarodników jest metodologia stosowana do barwienia struktur oporu stanowiące pewne rodzaje bakterii, gdy w niekorzystnych warunkach; Struktury te odpowiadają formom przetrwania.

Istnieje wiele rodzajów, które tworzą zarodniki; jednak głównymi z nich są Bacillus i Clostridium. Te rodzaje są uważane za bardziej odpowiednie, ponieważ zawierają gatunki chorobotwórcze dla ludzi.

Barwienie zarodników metodą Shaeffera - Fultona lub Wirtza-Conklina. I tambe (oryginalny uploader), z Wikimedia Commons

Każdy Bacillus może spowodować powstanie zarodnika. W momencie barwienia preparatu zarodnik można znaleźć w obrębie Bacillus (endospore) lub poza nim (exospore). Przy konwencjonalnych technikach barwienia bakterii - takich jak barwienie Grama - zarodniki pozostają bezbarwne.

Obecnie istnieje kilka metod barwienia, które są w stanie penetrować grubą strukturę zarodnika w celu jego zabarwienia. Te metodologie są bardzo zróżnicowane; Należą do nich technika Dorner, barwienie Möellera i metodologia Shaeffer-Fulton, znana również jako Wirtz-Conklin.

Ze wszystkich wymienionych technik metodologia Shaeffera-Fultona jest najczęściej stosowana w rutynowych laboratoriach. Jej nazwa pochodzi od dwóch mikrobiologów, którzy stworzyli zabarwienie w 1930 roku: Alicii Shaeffer i MacDonalda Fultona. Jednak technika ta jest czasami nazywana Wirtz-Conklin na cześć dwóch bakteriologów z XX wieku.

Podstawa

Zarodniki nie plamią konwencjonalnymi plamami, ponieważ mają bardzo grubą ścianę. Złożony skład zarodników zapobiega przedostawaniu się większości barwników.

Jeśli zarodnik jest badany od zewnątrz do wewnątrz, obserwuje się następujące warstwy: pierwsza to egzosporium, które jest najcieńszą i zewnętrzną warstwą utworzoną przez glikoproteiny.

Dalej pojawia się naskórek, który zapewnia odporność na wysokie temperatury, a następnie kora zbudowana z peptydoglikanu. Później jest ściana podstawy, która chroni protoplast.

Zarodnik jest odwodnioną strukturą, która zawiera 15% wapnia i kwasu dipikolinowego. Dlatego większość technik barwienia zarodników polega na doprowadzeniu ciepła, aby barwnik mógł penetrować grubą strukturę.

Po zabrudzeniu zarodników nie można usunąć barwnika. W technice Shaeffera-Fultona zieleń malachitowa wnika do komórek wegetatywnych i po zastosowaniu ciepła przenika zarówno przetrwalniki, jak i egzospory.

Przez przemywanie wodą barwnik jest usuwany z komórki wegetatywnej. Dzieje się tak, ponieważ zielony barwnik malachitowy jest lekko zasadowy, więc słabo wiąże się z komórką wegetatywną.

Zamiast tego nie może wydostać się z zarodników i ostatecznie bakteria jest barwiona kontrastowo za pomocą safraniny. Ta podstawa jest ważna dla pozostałych technik, w których dzieje się coś podobnego.

Techniki barwienia zarodników

Aby przeprowadzić barwienie zarodników, należy uzyskać czystą kulturę podejrzanego szczepu, który ma być badany.

Hodowlę poddaje się działaniu ekstremalnych temperatur przez 24 godziny w celu pobudzenia mikroorganizmu do zarodnikowania. W tym celu kulturę można umieścić w piecu w 44 ° C lub w lodówce (8 ° C) na 24 lub 48 godzin.

Jeśli pozostawi się je zbyt długo w podanych temperaturach, obserwowane będą tylko egzospory, ponieważ wszystkie przetrwalniki opuściły już Bacillus.

Pod koniec tego czasu na czystym szkiełku należy umieścić kilka kropli sterylnego roztworu fizjologicznego. Następnie pobiera się małą porcję kultury i przygotowuje się do smarowania.

Następnie pozostawia się do wyschnięcia, utrwala na gorąco i barwi jedną z technik opisanych poniżej:

Technika Dornera

1- Przygotować w probówce stężoną zawiesinę zarodnikującego mikroorganizmu w wodzie destylowanej i dodać taką samą objętość przefiltrowanej fuksyny karbolu Kinyoun.

2- Umieścić probówkę w kąpieli z wrzącą wodą na 5 do 10 minut.

3- Na czystym szkiełku wymieszać kroplę poprzedniej zawiesiny z kroplą 10% wodnego roztworu nigrozyny, przegotowaną i przesączoną.

4- Rozprowadzić i szybko wysuszyć z delikatnym ciepłem.

5- Zbadaj obiektywem 100X (zanurzenie).

Zarodniki wybarwiają się na czerwono, a komórki bakterii wydają się prawie bezbarwne na ciemnoszarym tle.

Zmodyfikowana technika Dornera

1- Zawiesinę zarodnikującego mikroorganizmu rozprowadza się na szkiełku i utrwala w cieple.

2- Próbkę przykrywa się paskiem bibuły filtracyjnej, do którego dodaje się fuksynę karbolową. Barwnik jest podgrzewany przez 5 do 7 minut płomieniem palnika Bunsena, aż do wytworzenia się oparów. Następnie papier jest usuwany.

3- Preparat myje się wodą, a następnie suszy bibułą.

4- Przykryj rozmaz cienką warstwą 10% nigrozyny, używając drugiego szkiełka do rozprowadzenia nigrozyny lub igły.

Zabarwienie zarodników i bakterii jest takie samo jak to opisane w stanie techniki.

Technika Shaeffer - Fultona lub Wirtza-Conklina

1- Wykonać na szkiełku cienki rozmaz zawiesiną zarodnikującego mikroorganizmu i utrwalić na gorąco.

2- Przykryć szkiełko 5% wodnym roztworem zieleni malachitowej (na szkiełku można umieścić bibułę filtracyjną).

3- Podgrzać nad płomieniem palnika Bunsena, aby spowodować uwolnienie oparów i usunąć płomień. Powtórz operację przez 6 do 10 minut. Jeśli podczas zabiegu zielony roztwór malachitu za bardzo wyparuje, można dodać więcej.

4- Wyjmij papier filtracyjny (jeśli jest zainstalowany) i umyj go wodą.

5- Przykryć szkiełko 0,5% wodną safraniną na 30 sekund (niektóre warianty techniki wykorzystują 0,1% wodną safraninę i pozostawić na 3 minuty).

Dzięki tej technice zarodniki wydają się zielone, a laseczki czerwone.

Wadą jest to, że przetrwalniki młodych kultur nie wybarwiają się dobrze, ponieważ wydają się wyjątkowo przezroczyste lub bezbarwne. Aby tego uniknąć, zaleca się stosowanie kultur inkubowanych przez 48 godzin.

Technika Möellera

1- Przykryj rozmaz chloroformem na 2 minuty.

2- Wyrzucić chloroform.

3- Pokryć 5% kwasem chromowym na 5 minut.

4- Umyć wodą destylowaną

5- Arkusz przykrywa się fuksynem karbolowym i wystawia na działanie płomienia palnika Bunsena do momentu wydzielenia oparów; następnie jest usuwany z płomienia na kilka chwil. Operacja jest powtarzana do zakończenia 10 minut.

6- Umyć wodą.

7- Użyj zakwaszonego etanolu (alkoholu solnego), aby odbarwić. Pozostawia się na 20 lub 30 sekund.

8- Umyć wodą destylowaną.

9- Kontrastinuj, przykrywając arkusz błękitem metylenowym przez 5 minut.

10- Umyć wodą destylowaną.

11- Pozostaw do wyschnięcia, a próbka zostanie przeniesiona do mikroskopu.

Zarodniki są czerwone, a laseczki niebieskie. Ważne jest, aby nie wdychać oparów, ponieważ są one toksyczne i na dłuższą metę mogą być rakotwórcze.

Zmodyfikowana technika Möellera bez ciepła

W 2007 Hayama i jego współpracownicy stworzyli modyfikację techniki Möellera. Wyeliminowali etap podgrzewania barwnika i zastąpili go dodając 2 krople środka powierzchniowo czynnego Tergitol 7 na każde 10 ml roztworu fuksyna karbol-karbol. Uzyskano takie same wyniki.

Aplikacje

Zabarwienie zarodników dostarcza bardzo cennych i przydatnych informacji do identyfikacji patogenu, ponieważ jego obecność, kształt, położenie w obrębie pałeczki i zdolność do deformacji komórki wegetatywnej lub nie, to dane, które mogą wskazywać gatunek związane z określonym gatunkiem.

W tym kontekście warto powiedzieć, że zarodniki mogą być okrągłe lub owalne, mogą znajdować się w środku lub też w pozycji paracentralnej, podminalnej lub końcowej.

Diagram przedstawiający kształt i położenie przetrwalników i egzospor

Przykłady

- Clostridium difficile tworzy owalny zarodnik w położeniu końcowym, który deformuje pałeczkę.

- Zarodnik Clostridium tertium jest owalny, nie deformuje pałeczki i znajduje się na poziomie końcowym.

- Przetrwalnik Clostridium tetani jest nieuleczalny i deformuje pałeczkę, nadając jej wygląd podudzia.

- Zarodniki Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy i C. septicum są okrągłe lub owalne poniżej końcówki i deformują pałeczkę.

- Endospor Clostridium sordelli znajduje się w pozycji centralnej, z lekkim odkształceniem.

Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. (Wyd. 5). Argentyna, od redakcji Panamericana SA

Bibliografia

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Propozycja uproszczonej techniki barwienia przetrwalników bakterii bez stosowania ciepła - udana modyfikacja metody Moellera. Eur J Med Res.2007; 16 12 (8): 356–9.
2. Współtwórcy Wikipedii. Bejca Moeller. Wikipedia, wolna encyklopedia. 3 listopada 2018, 03:28 UTC. Dostępne pod adresem: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Podręcznik technik mikrobiologicznych. Katedra Nauk Podstawowych Akademii Mikrobiologii. Narodowy Instytut Politechniczny.
4. "Endospora." Wikipedia, wolna encyklopedia. 25 lutego 2018, 10:20 UTC. 10 stycznia 2019, 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J i współpracownicy. (2006). Personel autonomicznej wspólnoty Estremadury. Szczegółowy program Tom IV. Od redakcji MAD. Sewilla-Hiszpania, pp 211–212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006), Specjalistyczny technik laboratoryjny, Galicyjska Służba Zdrowia (SERGAS). Tematyka programu numer 2. Od redakcji MAD. Sewilla-Hiszpania, str. 79–80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. (Wyd. 5). Argentyna, od redakcji Panamericana SA
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentyna. Od redakcji Panamericana SA