BARWIENIE GIEMSA: PRZESŁANKI, MATERIAŁY, TECHNIKA I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Barwnikiem Giemsa jest typu barwienia próbek klinicznych, w odniesieniu do mieszaniny barwników kwasowych i zasadowych. Jego powstanie zostało zainspirowane pracą Romanowsky'ego, gdzie Gustav Giemsa, chemik i bakteriolog pochodzący z Niemiec, udoskonalił ją, dodając glicerol stabilizujący związki.

Zmiany wprowadzone w oryginalnej technice Romanowskiego pozwoliły znacznie poprawić obserwacje mikroskopowe, dlatego technika ta została ochrzczona nazwą barwienia Giemsa.

Różne próbki barwione barwnikiem Giemsa. A. Trypanosoma evansi we krwi obwodowej. B. Normalne krwinki. C. Borrelia theileri we krwi obwodowej. D. chłoniak Burkitta.

Ponieważ jest to prosta do wykonania technika, wysoce funkcjonalna i ekonomiczna, jest obecnie szeroko stosowana w laboratorium klinicznym do wymazów hematologicznych, próbek szpiku kostnego i skrawków tkanek.

Technika barwienia Giemsa jest bardzo przydatna w badaniach cytologicznych, ponieważ umożliwia obserwację określonych struktur komórkowych. Technika ta wybarwia cytoplazmy, jądra, jąderka, wakuole i ziarnistości komórek, będąc w stanie rozróżnić nawet drobne ślady chromatyny.

Ponadto można wykryć znaczące zmiany w wielkości, kształcie lub zabarwieniu jądra, gdzie można zwizualizować utratę związku jądro-cytoplazma.

Z drugiej strony pozwala na identyfikację niedojrzałych komórek szpiku kostnego i krwi obwodowej, co jest istotne w diagnostyce poważnych chorób, takich jak białaczka. Można również wykryć m.in. hemopasożyty, bakterie pozakomórkowe i wewnątrzkomórkowe, grzyby.

W cytogenetyce jest szeroko stosowany, ponieważ można badać mitozę komórek.

Podstawa barwienia Giemsa

Barwniki typu Romanowskiego opierają się na zastosowaniu kontrastu między barwnikami kwasowymi i zasadowymi, aby uzyskać wybarwienie odpowiednio struktury zasadowej i kwasowej. Jak można zauważyć, istnieje powinowactwo barwników kwasowych do barwienia struktur podstawowych i odwrotnie.

Podstawowym używanym barwnikiem jest błękit metylenowy i jego utlenione pochodne (Azure A i Azure B), natomiast barwnikiem kwasowym jest eozyna.

Struktury kwasowe komórek to między innymi kwasy nukleinowe, granulki segmentowanych bazofili, dlatego zostaną zabarwione błękitem metylenowym.

W tym samym sensie podstawową strukturą komórek jest hemoglobina i niektóre granulki, takie jak między innymi zawarte w segmentowanych eozynofilach; te będą poplamione eozyną.

Z drugiej strony, ze względu na to, że błękit metylenowy i lazur charakteryzują się tym, że są barwnikami metachromatycznymi, mogą one nadawać różnym strukturom zmienny odcień w zależności od obciążenia posiadanych polianionów.

W ten sposób strategiczne połączenie barwników zasadowych i kwasowych pozwala uzyskać szerokie spektrum kolorów, zgodnie z biochemiczną charakterystyką każdej struktury, przechodząc przez bladoniebieskie, ciemnoniebieskie, liliowe i fioletowe w przypadku struktur kwasowych.

Podczas gdy zabarwienie zapewniane przez eozynę jest bardziej stabilne, generuje kolory między czerwono-pomarańczowym a łososiowym.

materiały

Materiały do ​​przygotowania roztworu podstawowego

Przygotowanie roztworu podstawowego wymaga odważenia 600 mg sproszkowanego barwnika Giemsy, odmierzenia 500 cm3 bezacetonowego alkoholu metylowego i 50 cm3 obojętnej gliceryny.

Jak przygotować roztwór podstawowy

Umieść ciężki proszek Giemsa w moździerzu. Jeśli są grudki, należy je spryskać. Następnie dodać znaczną ilość odmierzonej gliceryny i bardzo dobrze wymieszać. Otrzymaną mieszaninę wlewa się do bardzo czystej bursztynowej butelki.

Resztę gliceryny umieszcza się w moździerzu. Wymieszaj ponownie, aby oczyścić resztę barwnika, który przywarł do ścianek zaprawy i wlej do tego samego słoika.

Butelkę zamyka się i umieszcza w łaźni wodnej o temperaturze 55 ° C na 2 godziny. Gdy jest w łaźni wodnej, delikatnie wstrząsaj miksturą co około pół godziny.

Następnie mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia, aby umieścić alkohol. Wcześniej część odmierzonego alkoholu umieszcza się w moździerzu, aby zakończyć przemywanie pozostałego barwnika, a następnie dodaje się go do mieszaniny wraz z pozostałą częścią alkoholu.

Preparat należy pozostawić na minimum 2 tygodnie do dojrzewania. Użytą część roztworu podstawowego należy przefiltrować.

Aby uniknąć zanieczyszczenia preparatu, zaleca się przeniesienie porcji, która będzie w ciągłym użyciu, do małej bursztynowej buteleczki z zakraplaczem. Uzupełniaj za każdym razem, gdy skończy się odczynnik.

Materiały do ​​przygotowania roztworu buforowego

Z drugiej strony, roztwór buforowy o pH 7,2 przygotowuje się w następujący sposób:

Do 1000 cm3 odważono 6,77 g fosforanu sodu (bezwodnego) (NaHPO ₄ ), 2,59 g diwodorofosforanu potasu (KH ₂ PO ₄ ) i wodę destylowaną.

Końcowe przygotowanie barwnika

W celu przygotowania końcowego roztworu do barwienia odmierza się 2 ml przefiltrowanego roztworu podstawowego i miesza z 6 ml roztworu buforowego. Zamieszaj miksturę.

Istotnym faktem, który należy wziąć pod uwagę, jest to, że techniki barwienia mogą się zmieniać w zależności od firmy handlowej.

Dodatkowe materiały potrzebne do wykonania kolorowania

Poza opisanymi materiałami należy mieć pomosty do barwienia, koszulki z wodą lub buforem do prania, szkiełka lub pokrowce na przedmioty, stoper do kontrolowania czasu barwienia i bibułkę lub jakiś materiał, który można wysuszyć ( gaza lub bawełna).

Technika

Proces barwienia

1) Przed barwieniem rozmaz próbki musi być gotowy na czystym szkiełku.

Próbkami mogą być krew, szpik kostny, skrawki histologiczne lub próbki z szyjki macicy i pochwy. Zaleca się, aby pasty były cienkie i miały 1 lub 2 godziny wyschnięcia przed koloryzacją.

2) Na pomoście do kolorowania umieść wszystkie arkusze, które mają być pokolorowane. Zawsze pracujesz w tej samej kolejności, a każdy arkusz jest dobrze zidentyfikowany.

3) Nanieś kilka kropli 100% alkoholu metylowego (metanolu) na rozmaz i pozostaw na 3 do 5 minut w celu utrwalenia i odwodnienia próbki.

4) Odrzucić metanol obecny na arkuszu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.

5) Po wyschnięciu umieść końcowy roztwór barwiący za pomocą zakraplacza, aż cały arkusz zostanie zakryty. Pozostaw na 15 minut. Niektórzy autorzy zalecają do 25 min. To zależy od firmy.

6) Opróżnij plamę i przemyj rozmaz wodą destylowaną lub roztworem buforowym 7,2.

7) Na bibule pozostawić arkusze do wyschnięcia na wolnym powietrzu, ułożone pionowo za pomocą podpórki.

8) Wyczyść tył szkiełka wacikiem nasączonym alkoholem lub wacikiem, aby usunąć wszelkie ślady plamy.

Narzędzia

Technika barwienia Giemsa znajduje zastosowanie w różnych dziedzinach, m.in .: hematologii, mikologii, bakteriologii, parazytologii, cytologii i cytogenetyce.

Hematologia

Jest to najczęstsze zastosowanie tej plamy. Dzięki niemu można zidentyfikować każdą z komórek obecnych w próbkach szpiku kostnego lub krwi obwodowej. Oprócz oszacowania liczby każdej serii, możliwości wykrycia leukocytozy lub leukopenii, trombocytopenii itp.

Ponieważ jest czuły w identyfikacji niedojrzałych komórek, ma znaczenie w diagnostyce ostrych lub przewlekłych białaczek. Możliwe jest również zdiagnozowanie anemii, takiej jak m.in. anemia sierpowata, sierpowata.

Mikologia

Na tym obszarze często wykorzystuje się go do wyszukiwania Histoplasma capsulatum (wewnątrzkomórkowego grzyba dimorficznego) w próbkach tkanek.

Bakteriologia

W rozmazach hematologicznych barwionych Giemsą można wykryć Borrelias sp. U pacjentów, u których występuje choroba zwana nawracającą gorączką. Krętki są bogate w erytrocyty, w próbkach pobranych w szczycie gorączki.

Możliwe jest także uwidocznienie wewnątrzkomórkowych bakterii, takich jak Rickettsia sp i Chlamydia trachomatis, w zakażonych komórkach.

parazytologia

W dziedzinie parazytologii barwienie Giemsa umożliwiło diagnozowanie chorób pasożytniczych, takich jak malaria, choroba Chagasa i leiszmanioza.

W pierwszych dwóch pasożyty odpowiednio Plasmodium sp i Trypanosoma cruzi można zobaczyć we krwi obwodowej zakażonych pacjentów, można je znaleźć w różnych stadiach w zależności od stopnia zaawansowania choroby.

Aby usprawnić wyszukiwanie pasożytów we krwi, zaleca się stosowanie barwnika Giemsa zmieszanego z barwnikiem May-Grünwald.

Podobnie, leiszmaniozy skórne można zdiagnozować, oceniając próbki biopsji skóry zabarwione metodą Giemsy, w których znaleziono pasożyta.

Cytologia

Barwienie Giemsa jest również wykorzystywane do badań cytologicznych próbek z szyjki macicy, chociaż nie jest to najczęściej stosowana technika do tego celu.

Ale w przypadku niedoboru zasobów można go użyć, mając podobną funkcjonalność do tej oferowanej przez technikę Papanicolaou i po niższych kosztach. Wymaga to jednak wiedzy eksperta ze strony egzaminatora.

Cytogenetyka

Istotną cechą barwienia Giemsa jest jego zdolność do silnego wiązania się z regionami DNA bogatymi w adeninę i tyminę. Pozwala to na wizualizację DNA podczas mitozy komórki, w różnych stanach kondensacji.

Badania te są niezbędne do wykrycia aberracji chromatycznych, takich jak duplikacje, delecje lub translokacje różnych regionów chromosomów.

Badania wykazujące skuteczność barwienia Giemsa

Cannova i wsp. (2016) porównali 3 techniki barwienia w diagnostyce leiszmaniozy skórnej.

W tym celu wykorzystali próbki uzyskane od zwierzęcia doświadczalnego (Mesocrisetus auratus) eksperymentalnie zaszczepionego Leishmanias.

Autorzy wykazali, że barwienie Giemsa było lepsze niż barwienie Pap-mart® i Gaffney. Dlatego uznali, że barwienie Giemsa jest idealne do diagnozowania leiszmaniozy skórnej.

Doskonałe wyniki uzyskane przez autorów wynikają z faktu, że kombinacja barwników tworzących mieszaninę Giemsy stwarza warunki niezbędne do stworzenia korzystnego kontrastu, pozwalającego na wyraźne rozróżnienie struktur amastigota, zarówno wewnątrzkomórkowych, jak i zewnątrzkomórkowych.

Inne techniki (Pap-mart® i Gaffney) też to zrobiły, ale w słabszy sposób i przez to trudniejsze do wizualizacji. Dlatego w parazytologicznej diagnostyce leiszmaniozy zaleca się stosowanie barwnika Giemsa.

Podobnie w badaniu Ramírez i wsp. (1994) oceniano przydatność wybarwień Giemsa i Lendrum w rozmazach spojówkowych do identyfikacji Chlamydia trachomatis.

Autorzy ustalili, że barwniki Giemsa i Ledrum mają taką samą specyficzność, ale stwierdzono, że Giemsa jest bardziej wrażliwy.

To wyjaśnia, dlaczego barwnik Giemsa jest obecnie najczęściej stosowany w diagnostyce zakażeń chlamydiami, zwłaszcza jeśli jest mało zasobów.

Źródło: PanReac Applichem ITW Reagents. Plama Giemsa. Wersja 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Hiszpania.

Zalecenia dotyczące dobrego barwienia

Nie należy przyspieszać schnięcia arkuszy. Należy spodziewać się rozsądnego czasu na wyschnięcie go na świeżym powietrzu. Około 2 godziny.

Dla najlepszych rezultatów koloruj natychmiast po 2 godzinach.

Aby rozmazy utrwalały się i barwiły lepiej, próbkę należy rozłożyć na szkiełku w taki sposób, aby pozostała cienka i jednorodna warstwa.

Preferowaną próbką krwi jest krew kapilarna, ponieważ rozmaz wykonywany jest bezpośrednio z kropli krwi, dlatego próbka nie zawiera żadnych dodatków, co sprzyja utrzymaniu struktur komórkowych.

Jeśli jednak używana jest krew żylna, jako antykoagulant należy stosować EDTA, a nie heparynę, ponieważ heparyna zwykle deformuje komórki.

Typowe błędy w barwieniu Giemsy

W praktyce tego kolorowania można popełnić błędy. Świadczą o tym nagłe zmiany tonacji struktur.

Niezwykle niebieskie zabarwienie

Może to być spowodowane:

• Bardzo grube rozmazy
• Przekroczenie czasu barwienia
• Umyć niedostatecznie.
• Stosowanie odczynników znacznie powyżej obojętnego (zasadowego) pH.

W tych warunkach kolory następujących struktur są zniekształcone w taki sposób, że erytrocyty zamiast barwienia łososiowo-różowego będą miały kolor zielony, granulki eozynofili, które muszą być zabarwione na ceglastoczerwony, staną się niebieskawe lub szare i tak dalej będą odchylenie w zwykłych tonach.

Zabarwienie nadmiernie różowe

Może to być spowodowane:

• Niewystarczający czas barwienia.
• Długotrwałe lub nadmierne mycie.
• Złe suszenie.
• Stosowanie silnie kwaśnych odczynników.

W tym konkretnym przypadku struktury, które normalnie wybarwiają się na niebiesko, nie będą prawie widoczne, podczas gdy struktury, które barwią się na różowo, będą miały znacznie przesadzone odcienie.

Przykład: Czerwone krwinki zmienią kolor na jaskrawoczerwony lub jasnopomarańczowy, chromatyna jądrowa będzie jasnoróżowa, a granulki eozynofili zabarwi się na intensywnie jaskrawoczerwone.

Obecność osadów w rozmazie

Przyczynami mogą być:

• Używaj brudnych lub źle wypranych folii.
• Nie pozwól, aby rozmaz dobrze wysechł.
• Pozostawienie roztworu mocującego na zbyt długi czas.
• Niedostateczne pranie po zakończeniu barwienia.
• Niewystarczająca filtracja lub brak filtracji używanego barwnika.

Obecność artefaktów morfologicznych

Artefakty morfologiczne mogą pojawiać się w rozmazach, co utrudnia wizualizację i interpretację obecnych struktur. Jest to spowodowane:

• Rodzaj zastosowanego antykoagulanta, np. Heparyna.
• Stosowanie brudnych, zniszczonych lub tłustych filmów.

Tryb przechowywania

Po przygotowaniu barwnik należy przechowywać w temperaturze pokojowej (15 - 25 ° C), aby zapobiec wytrącaniu się barwnika. Powinien być przechowywany w szczelnie zamkniętym bursztynowym pojemniku.

Bibliografia

1. Cannova D, Brito E i Simons M. Ocena technik barwienia w diagnostyce leiszmaniozy skórnej. Salus. 2016; 20 (2): 24-29.
2. Odczynniki PanReac Applichem ITW. Plama Giemsa. Wersja 2: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Hiszpania.
3. Clark G. Staining procedure (1981), 4thed. Williams & Willkins.
4. Applied Clinical Chemistry. Barwnik Giemsa do diagnostyki in vitro. Dystrybutor: cromakit.es
5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F i Grazioso C. Ważność plam Giemsa i Lendrum w rozmazach spojówkowych w celu identyfikacji Chlamydia trachomatis. Bol z Sanit Panam. 1994; 116 (3): 212–216.
6. Casas-Rincón G. General Mycology. 1994. Wydanie drugie Central University of Venezuela, Library Editions. Wenezuela Caracas.
7. „Plama Giemsa”. Wikipedia, wolna encyklopedia. 1 września 2017 r., 01:02 UTC. 6 grudnia 2018, es.wikipedia.org.