BARWIENIE METODĄ GRAMA: UZASADNIENIE, MATERIAŁY, TECHNIKA I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Barwienie metodą Grama jest najprostszym i najbardziej użyteczne barwienia techniką w mikrobiologii diagnostycznej. Technika ta została stworzona przez duńskiego lekarza Hansa Christiana Grama w 1884 roku, któremu udało się sklasyfikować bakterie jako Gram dodatnie i Gram ujemne, na podstawie składu ściany komórkowej.

Technika została poddana pewnym modyfikacjom przez Huckera w 1921 roku w celu stabilizacji odczynników i poprawy jakości barwienia, dlatego barwienie metodą Grama jest również znane jako Grama-Huckera.

Różne rozmazy barwione barwnikiem Grama. A. ziarniaki Gram-dodatnie. B. Pałeczki Gram-ujemne. C. Gram-dodatnie, polimorfojądrowe i jednojądrzaste pałeczki. D. Drożdże.

Dzięki tej technice można również obserwować kształt mikroorganizmów, to znaczy, czy są to między innymi ziarniaki, pałeczki, coccobacilli, pleomorficzne, nitkowate. Jak również jego dystrybucja w przestrzeni: w klastrze, w łańcuchu, w izolacji, w parach, w tetradach itp.

W przypadku podejrzenia zakażenia bakteryjnego większość otrzymanych próbek należy rozmazać na szkiełku i zabarwiać metodą Grama do badania mikroskopowego.

Raport Grama poinstruuje lekarza, jaki rodzaj drobnoustroju może być przyczyną zakażenia, przed uzyskaniem ostatecznego wyniku posiewu.

W niektórych przypadkach życie pacjenta jest bardzo zagrożone, dlatego lekarze pilnie potrzebują raportu Grama, aby poddać się leczeniu empirycznemu, czekając na identyfikację mikroorganizmu.

Na przykład, jeśli Grama wykaże, że w płynie mózgowo-rdzeniowym znajdują się ziarniaki Gram-dodatnie, lekarz poprowadzi początkową terapię antybiotykami, które eliminują ten typ bakterii, zgodnie z ustalonymi protokołami.

Gdy nadejdzie ostateczny wynik z nazwą wyizolowanego mikroorganizmu i jego odpowiednim antybiogramem, lekarz oceni, czy należy zmienić terapię. Decyzja ta zostanie podjęta w oparciu o badanie wrażliwości drobnoustroju na przyjmowane przez niego antybiotyki oraz ewolucję pacjenta.

Podstawa

Jest to technika, która składa się z 4 podstawowych kroków: barwienia, utrwalania zaprawą, odbarwiania i barwienia kontrastowego. Dlatego technika ta oprócz barwienia bakterii pozwala także na ich różnicowanie.

Pierwszym używanym barwnikiem jest fiolet krystaliczny. Ma powinowactwo do peptydoglikanu i zabarwi wszystkie obecne bakterie na fioletowo, następnie umieszcza się lugol, który działa jak zaciek, to znaczy indukuje tworzenie nierozpuszczalnych kompleksów fioletu krystalicznego z jodem - białek rybonuklearnych w komórce. .

Bakterie Gram-dodatnie, posiadające grubą ściankę peptydoglikanu, tworzą więcej kompleksów (fiolet krystaliczny-jod), dzięki czemu zatrzymują barwnik.

Dodatkowo wpływa to również na to, że ściana bakterii Gram-dodatnich zawiera większą ilość kwasów nienasyconych, które wykazują duże powinowactwo do utleniaczy (Lugol).

Tymczasem bakterie Gram-ujemne mają cienką warstwę peptydoglikanu, co powoduje, że bakterie tworzą mniej kompleksów niż bakterie Gram-dodatnie.

Następnie następuje etap odbarwienia, w którym bakterie Gram dodatnie i Gram ujemne zachowują się inaczej.

Bakterie Gram-ujemne zawierają zewnętrzną błonę bogatą w lipopolisacharydy, która jest częścią ich ściany komórkowej. Tłuszcze są niszczone w kontakcie z alkoholem acetonowym, więc zewnętrzna błona ulega destabilizacji, uwalniając fioletowy kryształ.

W ten sposób przeciwdziała się mu następnie safraniną lub podstawową fuksyną, zmieniając kolor na czerwony.

W przypadku bakterii Gram-dodatnich są one odporne na blaknięcie, ponieważ wybielacz działa zamykając pory, zapobiegając wyciekaniu kompleksu fiolet krystaliczny / jod.

Dlatego zabarwienie fioletem krystalicznym pozostaje stabilne i nie ma miejsca na safraninę lub fuksynę. Dlatego te bakterie barwią się na ciemnoniebiesko lub fioletowo.

materiały

Zestaw do barwienia Grama składa się z:

• Fioletowe szkło
• Lugol
• Alkohol acetonowy
• Safranina lub podstawowa fuksyna

Przygotowanie barwników i odczynników

Roztwór fioletu krystalicznego

Rozwiązanie:

Fioletowy kryształ ------------- 2 gr

Alkohol etylowy 95% ----------- 20cc

Rozwiązanie B:

Szczawian amonu ----------- 0,8 gr

Woda destylowana ------------- 80 cm3

W celu ostatecznego przygotowania fioletu krystalicznego, roztwór A należy rozcieńczyć w stosunku 1:10 wodą destylowaną i zmieszać z 4 częściami roztworu B. Mieszaninę przed użyciem przechowuje się przez 24 godziny. Przefiltrować do bursztynowej butelki do barwienia za pomocą bibuły filtracyjnej.

Porcję przeznaczoną do codziennego stosowania przelać do bursztynowej butelki z zakraplaczem.

Iodo-Lugol

Zważ i zmierz wskazaną ilość każdego związku w następujący sposób:

Kryształy jodu ------------- 1gr

Jodek potasu ------------- 2gr

Woda destylowana ------------- 300 cm3

Jodek potasu stopniowo rozpuszcza się w wodzie, a następnie dodaje się jod. Roztwór wlewa się do bursztynowej butelki.

Codzienną porcję należy przelać do mniejszej bursztynowej butelki z zakraplaczem.

Wybielanie

95% alkohol etylowy -----------– 50 ml

Aceton ------------------ 50 ml

Jest przygotowywany w równych częściach. Dobrze przykryj, bo ma tendencję do parowania.

Umieść w butelce z zakraplaczem.

Preparat zapewnia przebarwienie w umiarkowanym czasie 5-10 sekund i jest jak najbardziej polecany.

Początkujący wolą używać tylko 95% alkoholu etylowego, gdzie blaknięcie jest wolniejsze niż 10 do 30 sekund.

Natomiast bardziej doświadczeni mogą używać czystego acetonu, gdzie przebarwienia pojawiają się bardzo szybko od 1 do 5 sek.

Kontrast

Roztwór podstawowy Safraniny

Safranina -------------– 2,5 gr

Alkohol etylowy 95% --------– 100 cm3

Po odważeniu wskazanej ilości safraniny rozpuszcza się ją w 100 ml 95% alkoholu etylowego.

Roboczy roztwór safraniny przygotowuje się z roztworu podstawowego.

W tym celu odmierz 10 cm3 roztworu podstawowego, dodaj 90 cm3 wody destylowanej, aby uzyskać 100 ml.

Zaleca się codzienne przenoszenie ilości do bursztynowej butelki z zakraplaczem.

Drobnoustroje, które słabo wybarwiają Gram-ujemne barwienie Grama-Huckera, takie jak niektóre beztlenowce, Legionella sp, Campylobacter sp i Brucella sp, można znacznie lepiej wybarwić za pomocą modyfikacji barwienia Gram-Huckera firmy Kopeloff, zwana barwnikiem Grama-Kopeloffa.

Ta technika zmienia barwnik safraniny na podstawową fuksynę. Dzięki tej modyfikacji możliwe jest efektywne zabarwienie wspomnianych mikroorganizmów.

Przechowywanie odczynników

Przygotowane barwniki należy przechowywać w temperaturze pokojowej.

Przygotowanie rozmazu próbki do zabarwienia

Próbka musi zawierać co najmniej 10 ⁵ mikroorganizmów, zanim możliwa będzie obserwacja mikroorganizmu w rozmazie. Rozmaz można wykonać z próbki bezpośredniej lub z kultur na podłożach stałych lub płynnych.

Rozmaz powinien być jednolity, dobrze rozprowadzony i niezbyt gruby, aby lepiej uwidocznić obecne struktury.

-Gram bezpośrednich próbek

Gram nie odwirowanego moczu

Mocz miesza się i 10 µl umieszcza na szkiełku. Obserwacja przynajmniej jednej bakterii / pola Dip wskazuje na infekcję.

Oznacza to, że kultura zawiera w przybliżeniu ponad 100000 cfu / ml (10 ⁵ CFU / ml) z moczem w 85% przypadków.

Ta metoda nie jest przydatna w przypadku liczby kolonii poniżej 100 000 CFU.

CSF Gram

CSF należy odwirować, usunąć supernatant, a osad rozprowadzić na szkiełku. Ta ciecz jest sterylna w normalnych warunkach; obserwacja bakterii wskazuje na infekcję.

Gram próbek z dróg oddechowych

Plwocina, popłuczyny oskrzelowe lub oskrzelowo-pęcherzykowe Gram, mimo że może występować wiele różnych mikroorganizmów, zawsze pomogą w rozpoznaniu, oprócz określenia rodzaju obserwowanych komórek.

W przypadku plwociny rozmaz należy przygotować z najbardziej ropnych porcji próbki.

Gram stolca

Nie zaleca się wykonywania Gram na tego typu próbkach, ponieważ nie ma to wartości diagnostycznej.

-Gram upraw

Można to zrobić na dwa sposoby, jeden z kultur płynnych, a drugi z kultur stałych.

Płynne kultury

Z kultur płynnych jest to niezwykle proste; Kilka pieczeni mętnego bulionu umieszcza się pod palnikiem i umieszcza na czystym i suchym szkiełku, wykonując okrężne ruchy od środka do obrzeża, aby równomiernie rozprowadzić materiał.

Niech samo wyschnie na powietrzu. Po wyschnięciu materiał jest mocowany do arkusza za pomocą ciepła. Aby to zrobić, za pomocą pincety arkusz przepuszcza się 3 do 4 razy przez płomień palnika Bunsena, uważając, aby nie spalić materiału.

Prześcieradło pozostawia się do ostygnięcia i umieszcza się na moście barwiącym.

Uprawy stałe

Aby wykonać rozmaz dla barwienia Grama z litej kultury, należy postępować w następujący sposób:

Przed wyborem kolonii do pobrania preparat należy przygotować, umieszczając około dwóch kropli sterylnego roztworu soli fizjologicznej.

Jeśli oryginalna płytka hodowlana zawiera kilka różnych typów kolonii, do wykonania metody Grama zostanie wybrana izolowana kolonia każdej z nich. Każda kolonia zostanie pobrana z pętlą platynową do rozpuszczenia w roztworze soli fizjologicznej umieszczonym wcześniej na szkiełku.

Ruchy okrężne wykonuje się od środka do obrzeża, aby równomiernie rozprowadzić kolonię na szkiełku.

Niech samo wyschnie na powietrzu. Po wyschnięciu arkusz jest utrwalany na gorąco, jak wyjaśniono wcześniej (podpalając szkiełko zapalniczką), uważając, aby nie przypalić materiału.

Tę procedurę należy wykonać dla każdego rodzaju kolonii. Na kartce papieru należy zapisać kolejność obserwacji, na przykład:

Kolonia 1: Żółta kolonia beta-hemolityczna: W skupiskach obserwowano Gram-dodatnie ziarniaki

Kolonia 2: Kolonia o kremowym zabarwieniu, bez hemolizy: obserwowano Gram-ujemne coccobacilli.

Każdy slajd musi być opatrzony etykietą, aby wiedzieć, co obserwujemy.

Technika

Technika barwienia metodą Grama jest niezwykle łatwa do wykonania i stosunkowo niedroga i nie można jej pominąć w laboratorium mikrobiologicznym.

Odbywa się to w następujący sposób:

1. Utrwal rozmaz ciepłem i umieść na mostku barwiącym.
2. Przykryj szkiełko całkowicie fioletem krystalicznym przez 1 minutę.
3. Zmyć wodą Nie suszyć
4. Przykryj arkusz roztworem Lugola, pozostaw na 1 minutę. Zmyć wodą Nie suszyć.
5. Wybielać przez 5-10 sekund, delikatnie wstrząsając w acetonie alkoholowym. Lub umieść arkusz w pozycji pionowej i upuść krople odbarwiacza na powierzchnię, aż nadmiar niebarwionego fioletowego szkła zostanie usunięty. Nie przekracza.
6. Zmyć wodą Nie suszyć.
7. Wymień szkiełko na mostek barwiący i przykryj na 30 sekund safraniną (Gram-Hucker) lub 1 minutę podstawową fuksyną (Gram-Kopeloff).
8. Umyć wodą
9. Pozwól mu wyschnąć samoistnie w pozycji pionowej.

Po wyschnięciu umieść 1 kroplę olejku immersyjnego, aby obserwować go pod obiektywem 100X w mikroskopie świetlnym.

Użyteczność

Technika ta pozwala na rozróżnienie morfotintoralnych różnic większości bakterii.

Tym ubarwieniem wyróżniają się również drożdże. Przyjmują fiolet krystaliczny, to znaczy plamią Gram dodatnie.

Z drugiej strony można wyróżnić pręciki Gram-dodatnie tworzące przetrwalniki, w których w obrębie Bacillus obserwuje się wyraźną przestrzeń, w której utworzyła się endospora, chociaż zarodniki nie wybarwiają się dobrze. Inne techniki, takie jak Shaeffer-Fulton, są używane do barwienia zarodników.

Należy zauważyć, że to zabarwienie nie jest używane do barwienia wszystkich rodzajów bakterii, to znaczy są przypadki, w których barwienie nie działa.

W tym przypadku można wspomnieć o bakteriach pozbawionych ściany komórkowej. Na przykład: rodzaj Mycoplasma, sferoplasty, ureaplasma, formy L i protoplasty.

Bardzo mocno plami bakterie o ścianach bogatych w kwasy mykolowe, takie jak prątki, oraz bakterie wewnątrzkomórkowe, takie jak Chlamydias i Rickettsias.

Jest również nieskuteczny w barwieniu większości bakterii krętków.

Istnieją bakterie tego samego rodzaju, które można zaobserwować w tej samej próbce, co bakterie Gram dodatnie i Gram ujemne. Kiedy tak się dzieje, nazywa się to zmiennym barwieniem Grama, co może być spowodowane zmianami składników odżywczych, temperatury, pH lub stężenia elektrolitów.

Typowe błędy

Przesadne wybielanie

Wyolbrzymienie na etapie zmiany barwy może prowadzić do obserwacji fałszywych mikroorganizmów Gram-ujemnych.

Nie czekanie wystarczająco długo na wyschnięcie, aby dodać olejku immersyjnego

Może powodować barwienie bakterii Gram-ujemnych (fałszywie gramujemnych) u bakterii Gram-dodatnich. Dzieje się tak, ponieważ w starych kulturach istnieje prawdopodobieństwo, że bakterie są martwe lub zepsute iw takich warunkach bakterie nie zatrzymują fioletu krystalicznego.

Użyj bardzo starego roztworu Lugola:

Z biegiem czasu lugol traci swoje właściwości i blaknie. Jeżeli użyty zostanie już zdegenerowany odczynnik, nie utrwali on dobrze fioletu krystalicznego, dlatego istnieje możliwość uzyskania wizualizacji fałszywie Gram-ujemnych mikroorganizmów.

Niebieskie tło

Odpowiednio odbarwione tło będzie miało kolor czerwony. Niebieskie tło wskazuje, że odbarwienie było niewystarczające.

Bibliografia

1. Ryan KJ, Ray C. 2010. Sherris. Medical Microbiology, 6. wydanie McGraw-Hill, Nowy Jork, USA
2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. (Wyd. 5). Argentyna, od redakcji Panamericana SA
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentyna. Od redakcji Panamericana SA
4. Casas-Rincón G. 1994. Mykologia ogólna. 2nd Ed. Central University of Venezuela, Library Editions. Wenezuela Caracas.
5. „Plama Grama”. Wikipedia, wolna encyklopedia. 4 października 2018 r., 23:40 UTC. 9 grudnia 2018, 17:11. Zaczerpnięte z es.wikipedia.org.
6. González M, González N. 2011. Podręcznik mikrobiologii medycznej. 2. wydanie, Wenezuela: Dyrekcja ds. Mediów i publikacji Uniwersytetu w Carabobo.
7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Podstawowe barwienia w laboratorium mikrobiologicznym. Badania niepełnosprawności. 2014; 3 (1): 10-18.