BARWIENIE MAJOWE GRÜNWALD-GIEMSA: UZASADNIENIE, TECHNIKA I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

May Grunwald-Giemsa lub Pappenheima plama jest różnica barwienia techniką, która łączy Giemsa i maja Grünwald reagentów. Służy do różnicowania prawidłowych i nieprawidłowych krwinek w rozmazach krwi obwodowej i szpiku kostnego, a także do barwienia skrawków histologicznych i próbek cytologicznych.

Oba odczynniki - Giemsa i May Grünwald - pochodzą z barwienia typu Romanowsky'ego, techniki opartej na połączeniu barwników kwasowych i zasadowych.

Rozmaz przedstawiający podzielony na segmenty neutrofil i milocyt w przypadku przewlekłej białaczki szpikowej, zabarwiony barwnikiem May Grünwald Giemsa. Dr Ramon Simon-Lopez (https://es.m.wikipedia.org/wiki/Archivo:LMC-1.JPG) przez Wikipedia.org.

Giemsa ulepszył tę technikę, stabilizując mieszaninę eozyny, błękitu metylenowego i ich pochodnych za pomocą glicerolu. Zamiast tego May Grünwald używa eozyny i błękitu metylenowego, używając metanolu jako rozpuszczalnika. Ta strategiczna kombinacja przyniosła doskonałe rezultaty.

Chociaż pod względem obserwacji morfologii komórki działa podobnie jak barwienie Giemsa i Wrighta, technika ta poprawia poprzednie, udoskonalając barwienie pasożytów wywołujących malarię, chorobę Chagasa, leiszmaniozę i rzęsistkowicę.

Dodatkowo okazała się bardzo przydatną techniką do cytologicznego badania płynu nasiennego. Wyróżnia się nie tylko pokazaniem cech morfologicznych plemników, ale także możliwością różnicowania leukocytów, komórek nabłonka i komórek spermatogenezy z dużą skutecznością.

Podstawa

Technika bazuje na barwieniach Romanowskiego, w których barwniki kwasowe mają selektywne powinowactwo do podstawowych składników komórkowych, a składniki kwasowe przyciągają zabrudzenia zasadowe.

Wyjaśnione w inny sposób, zarówno struktury komórkowe, jak i barwniki mają dodatnie lub ujemne ładunki elektryczne; jak ładunki odpychają się, a różne ładunki przyciągają.

Na przykład podstawowe barwniki, takie jak błękit metylenowy, są naładowane dodatnio i są przyciągane do struktur z ładunkiem ujemnym. Dlatego ten barwnik barwi jądra bogate w DNA i RNA, które mają ujemnie naładowane grupy fosforanowe.

Barwione są również ziarnistości podzielonych bazofili i cytoplazmy jednojądrzastych krwinek białych zawierających RNA.

Podobnie, barwnik kwasowy ma ładunek ujemny, dlatego wiąże się z dodatnio naładowanymi strukturami, takimi jak erytrocyty i granulki segmentowanych eozynofili. Jeśli chodzi o granulki podzielonych neutrofili, wiążą one oba barwniki.

Różnorodność barwników

W tej technice współistnieje połączenie reakcji między barwnikami ortochromatycznymi i metachromatycznymi. Ortochromaty (eozyna i błękit metylenowy) wiążą się ze strukturą komórkową, z którą są związane i zapewniają stabilny, niezmienny kolor.

Z drugiej strony metachromaty (pochodne błękitu metylenowego lazurowego A i lazurowego B) zmieniają swój pierwotny kolor po połączeniu z określoną strukturą, a nawet mogą występować różne odcienie.

Wreszcie, krok, który podejmuje roztwór May Grünwald wymaga obecności wody, ponieważ bez niej barwnik wniknie w struktury, ale nie będzie się wiązał. Aby tak się stało, barwnik musi stać się polarny lub jonizować, a tym samym być zdolny do wytrącania się i wiązania się z powiązanymi strukturami.

Technika

materiały

- Slajdy.

- Mostki kolorowania.

- Rozwiązanie May-Grünwald.

- Plama Giemsa.

- Woda destylowana.

Stężony roztwór barwnika May Grünwald

Należy odważyć 0,25 g eozyny i błękitu metylenowego (barwienie według Maya Grünwalda) i rozpuścić w 100 ml metanolu. Następnie preparat miesza się przez 1 godzinę i pozostawia na 24 godziny. Pod koniec czasu jest filtrowany.

Aby zastosować technikę, barwnik May Grünwald należy rozcieńczyć w następujący sposób: na 200 ml rozcieńczonego barwnika odmierzyć 30 ml stężonego roztworu, dodać 20 ml roztworu buforowego i 150 ml wody destylowanej dostosowanej do pH 7,2-7,3 . Później jest mieszany i filtrowany.

Koncentrat barwników Giemsa

Odważyć 0,5 g lazuru-eozyny-błękitu metylenowego (barwienie wg Giemsy), rozpuścić w 50 ml metanolu i dodać do mieszaniny 50 ml gliceryny.

Aby wykonać technikę, rozcieńczyć 1:10 roztworem buforowym i pozostawić na 10 minut. W razie potrzeby można go przefiltrować.

Przygotowanie roztworu buforowego o pH 7,2

Należy je zważyć:

- 40 mg diwodorofosforanu potasu (KH2PO4).

- 151 mg 12-hydratu wodorofosforanu disodu (Na2HPO4).

Oba związki rozpuszcza się w 100 ml wody.

Procedura barwienia rozmazów krwi lub szpiku kostnego

Istnieją dwa tryby: klasyczny i szybki.

Tryb klasyczny

1. Przykryj rozmaz na 2 do 3 minut rozcieńczonym roztworem May-Grünwalda.
2. Przemyć buforowaną wodą destylowaną, aby usunąć poprzedni roztwór.
3. Przykryj tym samym buforowanym roztworem do płukania i pozostaw na 1 minutę. Chodzi o to, że poprzedni barwnik jest przymocowany do struktur, a jednocześnie komórki są nawodnione.
4. Dodaj 12 kropli rozcieńczonej nalewki Giemsa do zbuforowanej wody i przedmuchaj, aby wymieszać i ujednorodnić. Odstaw na 15 do 20 minut.
5. Umyj rozmaz buforowaną wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
6. Ustaw ostrość i obejrzyj zabarwione krwinki pod mikroskopem świetlnym przy użyciu obiektywu 40X. W razie potrzeby można użyć 100X.

Szybki tryb

1. Przykryj rozmaz rozcieńczoną barwnikiem May Grünwald przez 1 minutę.
2. Umyć buforowaną wodą destylowaną.
3. Zalej zbuforowaną wodą i odstaw na 1 minutę.
4. Dodaj rozcieńczoną barwnik Giemsa i pozostaw na 5 minut.
5. Umyć buforowaną wodą destylowaną i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.

Opisane tutaj techniki są wytycznymi, ale należy wziąć pod uwagę, że procedury i czasy barwienia różnią się w zależności od firmy handlowej, która dystrybuuje odczynniki. Wskazane jest postępowanie zgodnie z krokami ściśle wskazanymi przez każdy dom handlowy.

Technika barwienia rozmazów płynu nasiennego

1- Przykryj rozmaz cienką warstwą roztworu May Grünwald na 4 minuty.

2- Usuń barwnik i przemyj wodą destylowaną.

3- Umieść warstwę rozcieńczonego Giemsy (1:10) w wodzie destylowanej na 15 minut.

4- Usuń barwnik i przemyj wodą destylowaną.

5- Pozostawić do wyschnięcia i obserwować pod mikroskopem.

Oczekiwane kolory po zastosowaniu bejcy May Grünwald Giemsa

Ważne specyfikacje

Technika ta wymaga, aby odczynniki i roztwory do przemywania miały pH ustawione na 7,2-7,3, tak aby powinowactwa barwników do struktur komórkowych nie były zniekształcone, a oczekiwany kolor końcowy nie zmieniał się.

Aplikacje

Technika ta jest stosowana w laboratoriach klinicznych do barwienia rozmazów krwi obwodowej i szpiku kostnego, skrawków tkanek i cytologii.

W dziedzinie hematologii technika ta ma zasadnicze znaczenie w badaniu nieprawidłowości komórek pod względem kształtu, wielkości i liczby. Jest to bardzo cenne narzędzie do diagnostyki niektórych chorób, takich jak białaczki i anemie.

Ponadto jest niezwykle przydatny przy poszukiwaniu pasożytów w obszarach hematologicznych (Plasmodium sp i Trypanosoma cruzi) lub histologicznych (Leishmanias sp).

Cytologia pochwy

W przypadku cytologii pochwy technika ta jest szczególnie korzystna w przypadku obserwacji Trichomonas vaginalis. Jest to ważne odkrycie, ponieważ jego obecność symuluje obrazy raka in situ, które później znikają po wyeliminowaniu pasożyta.

Próbka nasienia

Jest idealnym narzędziem do badania próbek nasienia, ponieważ dostarcza cennych informacji na temat jakości nasienia.

Dane, które oferuje, dotyczą głównie liczby i morfologii, a także komórek towarzyszących, które mogą być obecne i które mają istotne znaczenie, takich jak komórki rozrodcze, leukocyty i komórki nabłonkowe.

Dzięki tej analizie można opisać nieprawidłowości obserwowane w nasieniu w głowie, szyi, części środkowej i części głównej.

Ponadto mogą również pomóc w wykazaniu przypadków hemospermii (obecność czerwonych krwinek w nasieniu) oraz leukospermii lub piospermii (zwiększona liczba leukocytów w nasieniu).

Bibliografia

1. Costamagna S, Prado M. Walidacja świeżego testu, barwienia May Grünwald-Giemsa i Grama oraz pożywki hodowlane do diagnozy Trichomonas vaginalis. Parasitol. 2001; 25 (1–2): 60–64. Dostępne w: scielo.
2. Laboratorium Merck KGaA. May Grünwald eozyna błękit metylenowy do mikroskopii.
3. „Plama May-Grünwald-Giemsa”. Wikipedia, wolna encyklopedia. 15 listopada 2018, 14:37 UTC. 8 stycznia 2019, 04:29: en.wikipedia.org
4. Glass Chemicals Laboratory Panreac. Odczynniki do technik histologicznych, hematologii i mikrobiologii. Dostępne pod adresem: glasschemicals.com
5. Retamales E, Manzo V. Zalecenie dotyczące barwienia rozmazów krwi w celu odczytania hemogramu. Krajowe i Referencyjne Laboratorium Biomedyczne. Instytut Zdrowia Publicznego Chile.
6. Sarabia L. Spermiogram według kryteriów WHO. Program Anatomii i Biologii Rozwojowej. Szkoła Medyczna. Uniwersytet Chile. Dostępne pod adresem: pp.centramerica.com