BARWIENIE ZIEHL-NEELSENA: UZASADNIENIE, ODCZYNNIKI I TECHNIKA - BIOLOGIA - 2026

Ziehl-Neelsena barwiących technika identyfikacji mikroorganizmy odporne na kwas alkoholu (ARA). Nazwa tej procedury mikrobiologicznej nawiązuje do jej autorów: bakteriologa Franza Ziehla i patologa Friedricha Neelsena.

Technika ta jest rodzajem barwienia różnicowego, które zakłada użycie różnych barwników w celu stworzenia kontrastu między strukturami, które chcesz obserwować, rozróżniać i później identyfikować. Barwnik Ziehl-Neelsen służy do identyfikacji niektórych rodzajów mikroorganizmów.

Bejca Ziehl-Neelsen

Niektóre z tych organizmów to mykobakterie (np. Mycobacterium tuberculosis), nocardia (np. Nocardia sp.) I niektóre jednokomórkowe pasożyty (np. Cryptosporidium parvum). Wiele bakterii można sklasyfikować za pomocą powszechnej techniki zwanej barwieniem metodą Grama.

Jednak niektóre grupy bakterii wymagają innych metod, aby móc je zidentyfikować. Techniki takie jak barwienie Ziehl-Neelsen wymagają kombinacji barwników z ciepłem, aby przymocować ten pierwszy do ściany komórkowej.

Potem następuje proces wybielania, który daje dwa efekty: odporność lub wrażliwość na przebarwienia przez kwasy i alkohole.

Podstawa

Uzasadnienie tej techniki barwienia opiera się na właściwościach ściany komórkowej tych mikroorganizmów. Ściana składa się z pewnego rodzaju kwasów tłuszczowych zwanych kwasami mykolowymi; Charakteryzują się bardzo długimi łańcuchami.

Gdy kwasy tłuszczowe mają bardzo długą strukturę, mogą łatwiej zachować barwniki. Niektóre rodzaje bakterii są bardzo trudne do wybarwienia metodą Grama ze względu na wysoką zawartość kwasów mykolowych w ścianie komórkowej.

Barwnik Ziehl-Neelsen wykorzystuje podstawową barwnik fuksyny karbol, będącej związkiem fenolowym. Ma zdolność do interakcji z kwasami tłuszczowymi ściany komórkowej, która w temperaturze pokojowej ma teksturę wosku.

Zabarwienie fuksyny Carbola nasila się w obecności ciepła, ponieważ wosk topi się, a cząsteczki barwnika szybciej przemieszczają się w ścianę komórkową.

Kwas, który jest używany później, służy do odbarwiania komórek, które nie zostały zabarwione, ponieważ ich ściana nie była wystarczająco związana z barwnikiem; dlatego siła kwaśnego wybielacza jest w stanie usunąć kwasowy barwnik. Komórki, które są odporne na to przebarwienie, nazywane są kwasoodpornymi.

Barwnik drugorzędny

Po odbarwieniu próbki kontrastuje się ją z innym barwnikiem zwanym barwnikiem wtórnym. Ogólnie stosuje się błękit metylenowy lub zieleń malachitową.

Barwnik wtórny plami materiał tła i w konsekwencji tworzy kontrast ze strukturami, które zostały zabarwione w pierwszym etapie. Tylko komórki odbarwione absorbują drugi barwnik (barwienie kontrastowe) i nabierają koloru, podczas gdy komórki kwasoodporne zachowują swój czerwony kolor.

Procedura ta jest często stosowana do identyfikacji Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium leprae, które nazywane są pałeczkami kwasoodpornymi.

Odczynniki

Barwnik podstawowy

Użyto 0,3% fuksyny karbolowej (przefiltrowanej). Barwnik ten wytwarza się z mieszaniny alkoholi: fenolu w etanolu (90%) lub metanolu (95%) iw tej mieszaninie rozpuszcza się 3 gramy zasadowej fuksyny.

Roztwór wybielający

Na tym etapie można stosować roztwory 3% kwasu alkoholowego lub 25% kwasu siarkowego.

Drugorzędny barwnik (przeciw-barwnik)

Barwnikiem najczęściej używanym do kontrastowania próbek jest zwykle 0,3% błękitu metylenowego. Jednak można również zastosować inne, takie jak 0,5% zieleń malachitowa.

Technika

Procedura barwienia kwasoodpornego

Przygotuj rozmaz bakteryjny

Preparat sporządza się na czystym, suchym szkiełku, z zachowaniem środków ostrożności dotyczących sterylności.

Suszenie mazi

Pozostaw rozmaz do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.

Podgrzej próbkę

Próbkę należy podgrzać, przykładając ogień do szkiełka poniżej. Utrwalanie alkoholem można wykonać, jeśli rozmaz nie został przygotowany przy użyciu plwociny (potraktowanej podchlorynem sodu w celu wybielenia) i jeśli nie będzie od razu plamił.

M. tuberculosis usuwa się wybielaczem i podczas procesu barwienia. Utrwalanie termiczne nieleczonej plwociny nie zabije M. tuberculosis, podczas gdy utrwalanie alkoholu jest bakteriobójcze.

Zakryj plamę

Bejca pokryta jest roztworem fuksyny karbolu (pierwotna bejca zasadowa).

Podgrzej plamę

Odbywa się to przez 5 minut. Powinieneś zauważyć wydzielanie się pary (około 60 ° C). Ważne jest, aby nie przegrzewać się i unikać spalenia próbki.

Jeśli chodzi o podgrzewanie plamy, należy zachować dużą ostrożność podczas podgrzewania fuksyny karbolowej, zwłaszcza jeśli barwienie odbywa się na tacy lub innym pojemniku, w którym zebrano wysoce łatwopalne chemikalia z poprzedniego barwienia.

Pod szkiełkami należy nałożyć tylko niewielki płomień, używając uprzednio zapalonego wacika zwilżonego kilkoma kroplami kwaśnego alkoholu, metanolu lub 70% etanolu. Unikaj używania dużego wacika nasączonego etanolem, ponieważ może to spowodować pożar.

Umyj plamę

Mycie należy wykonać czystą wodą. Jeśli woda z kranu nie jest czysta, najlepiej przemyć rozmaz wodą filtrowaną lub destylowaną.

Przykryj rozmaz kwaśnym alkoholem

Ten kwaśny alkohol powinien mieć 3%. Krycie przeprowadza się przez 5 minut lub do momentu dostatecznego przebarwienia rozmazu, tj. Jasnoróżowego koloru.

Należy wziąć pod uwagę, że kwaśny alkohol jest łatwopalny; dlatego należy go używać z dużą ostrożnością. Unikaj przebywania w pobliżu źródeł zapłonu.

Umyj plamę

Mycie powinno odbywać się czystą, destylowaną wodą.

Przykryj rozmaz plamą

Może to być plama z zieleni malachitowej (0,5%) lub błękitu metylenowego (0,3%) przez 1 lub 2 minuty, używając dłuższego czasu, jeśli rozmaz jest cienki.

Umyj plamę

Ponownie należy użyć czystej (destylowanej) wody.

Osuszać

Tył szkiełka należy wyczyścić, a plamę umieścić na statywie do wyschnięcia na powietrzu (do suszenia nie używać papieru chłonnego).

Zbadaj rozmaz pod mikroskopem

Należy użyć obiektywu 100X i olejku immersyjnego. Systematycznie skanuj rozmaz i zapisuj istotne obserwacje.

Zinterpretuj wyniki

Teoretycznie mikroorganizmy, które zabarwiają się na czerwono, są uważane za kwasoodporne (AAR +).

Wręcz przeciwnie, jeśli mikroorganizmy wybarwiają się na niebiesko lub zielono, w zależności od barwnika użytego jako przeciw-barwnik, uznaje się je za kwasoodporny ujemny (AAR-).

Bibliografia

1. Apurba, S. i Sandhya, B. (2016). Essentials of Practical Microbiology (1st ed.). Jaypee Brothers Medical Publishers.
2. Bauman, R. (2014). Microbiology with Diseases by Body System (4th ed.). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. i Killington, A. (1996). Wprowadzenie do mikrobiologii (1st ed.). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Laboratory Manual and Workbook in Microbiology: Applications to Patient Care (11th ed.). Edukacja McGraw-Hill.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Podręcznik mikrobiologii (wydanie 1). Publikacje BI PVT.