BARWIENIE NEGATYWNE: UZASADNIENIE, TECHNIKA, ZALETY I WADY - BIOLOGIA - 2026

Barwieniu negatywnym jest sposób barwienia specjalnego podkreślenia obecności kapsułki w niektórych mikroorganizmów , przede wszystkim Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae i Cryptococcus neoformans-, z próbek klinicznych lub czystych kultur.

Bezpośrednią próbką powszechnie używaną do barwienia ujemnego jest płyn mózgowo-rdzeniowy. Technika ta stanowi szybką alternatywę dla wstępnej diagnostyki zapalenia opon mózgowych, zwłaszcza Cryptococcus neoformans.

A. Kamień nazębny barwiony atramentem indyjskim B. Cryptococcus neoformans var gatti słabo otorbiony, tak jak występuje w naturze, przy użyciu nigrozyny. C. Cryptococcus neoformans var gatti z grubą torebką występującą w formie pasożytniczej, przy użyciu nigrozyny. D. Cryptococcus neoformans z lekko rozcieńczonym tuszem indyjskim. Gisell Quinde, z Wikimedia Commons / CDC, za pośrednictwem Wikimedia Commons / Źródło zdjęcia: Dostawcy treści: CDC / Dr. Leanor Haley, za pośrednictwem Wikimedia Commons

Podobnie barwnik ten może być stosowany ogólnie na plwocinie i sterylnych płynach, a także na szczepach uzyskanych z młodych czystych kultur. Do wykonania tej techniki wykorzystuje się atrament nigrozyny lub indyjski; dlatego jest to bardzo prosta i niedroga w zastosowaniu metodologia, która dostarcza informacji o dużej wartości diagnostycznej w krótkim czasie.

W tym sensie każde laboratorium jest w stanie przeprowadzić takie barwienie. Oczywiście laboratorium musi dysponować kompetentnym personelem zdolnym do rozpoznawania izolowanych lub pączkujących drożdży Cryptococcus neoformans oraz różnicowania ich od leukocytów i artefaktów, które może wykazywać próbka.

Podstawa

Nigrozyna i tusz indyjski działają w podobny sposób; w związku z tym każda z tych dwóch substancji może być używana zamiennie.

Technika ta nazywana jest barwieniem negatywnym, ponieważ działa odwrotnie niż pozostałe techniki barwienia. W tym, co pozostaje niebarwione, to struktura, której się szuka lub którą chce się zobaczyć; to znaczy mikroorganizmy.

Dlatego barwienie polega na zabarwieniu spodu mazi na ciemny kolor. W tym scenariuszu otoczone struktury będą wyróżniać się jasnym lub bezbarwnym kolorem.

Ogólnie drożdże są załamujące się, otoczone przezroczystą aureolą odpowiadającą kapsułce. Dzieje się tak, ponieważ tusz i nigrozyna są substancjami niezdolnymi do penetracji polisacharydu, który tworzy otoczkę żywych mikroorganizmów.

Warto zwrócić uwagę, że inne struktury, które mogą być obecne w bezpośredniej próbce, takie jak leukocyty czy czerwone krwinki, również nie przenikają.

Jeśli jednak mikroorganizmy są martwe, barwnik może przeniknąć do ich wnętrza, tak że zabarwienie to jest również przydatne do oceny żywotności mikroorganizmów.

Technika

materiały

Nigrozyna

Nigrozyna swoją nazwę zawdzięcza czarnemu kolorowi. Jest to substancja syntetyczna otrzymywana przez ogrzewanie mieszaniny związków organicznych - takich jak nitrobenzyna, anilina i chlorowodorek aniliny - przy użyciu katalizatora (żelaza lub miedzi) w tej reakcji.

Tusz chiński

Atrament chiński to substancja używana głównie przez Azjatów do pisania, tworzenia dzieł sztuki i malarstwa monochromatycznego. Jest bardzo popularny w kulturze chińskiej.

Uzyskuje się go z atramentu kałamarnicy zmieszanego z sproszkowanym węglem drzewnym, produktem spalania drzew o niskiej zawartości żywicy.

Możliwe jest również przygotowanie go z sadzy ze spalania węglowodorów (olejów roślinnych) wraz z żelatyną białkową, która nadaje mu odpowiednią konsystencję zapobiegającą wytrącaniu się cząstek węgla.

Specyfikacje pobierania próbek

- Nie wymaga postu.

- Próbka płynu mózgowo-rdzeniowego, plwociny lub sterylnej cieczy musi zawierać co najmniej 1 ml objętości i musi zostać natychmiast przeniesiona do laboratorium w temperaturze pokojowej.

- Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego i jałowego płynu muszą być pobierane przez lekarza specjalistę.

- Może to być również czysta kultura podejrzanego szczepu powiązanego z wyżej wymienionymi patogenami.

Wykonanie techniki z bezpośrednimi próbkami

- Próbki należy odwirować, następnie supernatant jest odrzucany i pobierany jest osad.

- Kroplę odwirowanego materiału (osad) i kroplę tuszu lub nigrozyny umieszcza się na czystym szkiełku.

- Należy go dobrze wymieszać i przykryć arkuszem szkiełka nakrywkowego, tak aby kropla rozlała się cienką warstwą bez przekraczania krawędzi.

- Następnie preparat mocuje się pod mikroskopem.

- Jeśli preparat jest zbyt ciemny, można go rozcieńczyć wodą.

Wykonanie techniki ze szczepami z hodowli

- Bardzo małą porcję młodej kultury pobiera się za pomocą igły do ​​zaszczepiania i rozpuszcza w kropli tuszu indyjskiego umieszczonej wcześniej na czystym szkiełku.

- Na górze umieszcza się szkiełko nakrywkowe.

- Jest obserwowany w mikroskopie przy 10X, a następnie przy 40X.

Możesz również rozpuścić część kolonii w wodzie destylowanej, a stamtąd wziąć kroplę i wymieszać ją z atramentem indyjskim. W ten sposób preparat nie będzie tak gęsty, co umożliwi obserwację struktur w izolacji; jeśli będą tłumy, nie będzie to dobrze przestrzegane.

Inna metodologia jest następująca:

- Umieścić kroplę kultury zawiesinowej na jednym końcu szkiełka.

- Umieść kroplę nigrozyny na tym samym końcu i wymieszaj.

- Za pomocą kolejnego szkiełka rozprowadź próbkę tak, jak podczas wykonywania rozmazu hematologicznego.

- Pozostaw do wyschnięcia i obserwuj pod mikroskopem.

Obserwacja mikroskopowa

Najpierw musisz skupić się na celu 10X, aby mieć szeroki widok na pole. Następnie należy sprawdzić, czy są wolne przestrzenie; jeśli tak, skup się na 40X, aby zobaczyć szczegóły.

Korzyść

- Jest łatwy do wykonania.

- To niedroga technika.

- Ta metoda nie wymaga utrwalania rozmazu na gorąco lub chemikaliami; dlatego mikroorganizmy są obserwowane bez zniekształceń.

- Świeży preparat nie wymaga suszenia, dzięki czemu można go od razu obserwować, szybko przynosząc rezultaty.

Niekorzyść

Po zmontowaniu świeże preparaty należy natychmiast obserwować; jeśli pozwolą im wyschnąć, nie będzie można ich obserwować i należy zainstalować nowy.

Barwienie tkanek tuszem indyjskim

Inną funkcją, jaką może pełnić tusz indyjski, są laboratoria patologiczne. Nakłada się to na chirurgicznie pobrane próbki tkanek w celu zaznaczenia marginesów resekcji guza.

Zaznaczoną tkankę spryskuje się kwasem octowym. Działa jak zaprawa i zapobiega wyciekaniu atramentu, gdy tkanka jest poddawana rutynowej obróbce w celu przygotowania biopsji.

Zabieg polega na zanurzeniu tkanki w alkoholu i ksylenie, a następnie zanurzeniu w parafinie. To oznaczenie prowadzi patologa podczas obserwacji tkanki, wskazując, gdzie znajduje się margines chirurgicznej resekcji lub inny interesujący punkt.

Bibliografia

1. „Nigrosina”. Wikipedia, wolna encyklopedia. 11 lipca 2017, 22:46 UTC. 6 stycznia 2019, 16:56: en.wikipedia.org
2. „Tusz chiński”. Wikipedia, wolna encyklopedia. 1 października 2018 r., 03:08 UTC. 6 stycznia 2019, 18:20: es.wikipedia.org/
3. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J i współpracownicy. (2006). Personel autonomicznej wspólnoty Estremadury. Szczegółowy program Tom IV. Od redakcji MAD. Sewilla-Hiszpania, pp 211–212.
4. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006), Specjalistyczny technik laboratoryjny, Galicyjska Służba Zdrowia (SERGAS). Tematyka programu numer 2. Od redakcji MAD. Sewilla-Hiszpania, str. 79–80.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentyna. Od redakcji Panamericana SA