AGAR LIA (ŻELAZO LIZYNOWE): PODKŁAD, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

LIA agar (lizyna żelaza) jest biochemiczne badanie stosowane do identyfikacji bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Medium to zostało stworzone przez Edwardsa i Fife'a w oparciu o formułę Falkowa.

Pierwotnie ten test był bulionem zawierającym peptony, ekstrakt drożdżowy, glukozę, L-lizynę, purpurę bromokrezolową i wodę destylowaną. Edwards i Fife dodali agar-agar, cytrynian amonu żelaza (III) i tiosiarczan sodu.

Pozytywny i negatywny test na dekarboksylację lizyny. Źródło: Zdjęcie i schemat własność autora mgr inż. Marielsa gil

Test zasadniczo polega na wykazaniu obecności enzymu dekarboksylazy lizyny, zdolnego do reagowania z grupą karboksylową aminokwasu L-lizyny. Dezaminacja aminokwasu może również wystąpić z powodu obecności enzymu deaminazy lizynowej.

Dodatkowo skład podłoża wskazuje na zdolność niektórych rodzajów bakterii do wytwarzania siarkowodoru. Wreszcie można również zaobserwować wytwarzanie lub brak gazu w ośrodku.

Podstawa

Peptony i ekstrakt drożdżowy

Podobnie jak większość podłoży hodowlanych, Lysine Iron Agar zawiera składniki, które stanowią źródło składników odżywczych niezbędnych do wzrostu bakterii. Składniki te reprezentowane są przez peptony i ekstrakt drożdżowy.

Glukoza

Podobnie agar zawiera glukozę jako węglowodan podlegający fermentacji. Wszystkie bakterie z rodziny Enterobacteriaceae są znane z fermentacji glukozy.

Ten krok jest kluczowy, ponieważ będzie odpowiedzialny za zakwaszenie podłoża, niezbędny warunek działania enzymu dekarboksylazy lizyny - jeśli jest obecny - na jego substrat.

U niektórych rodzajów bakterii można zaobserwować wytwarzanie gazu w wyniku fermentacji glukozy.

Gaz jest widoczny, gdy następuje przemieszczenie agaru w probówce, pozostawiając pustą przestrzeń na dnie probówki lub pęknięcie podłoża na dwie lub więcej części.

L-lizyna

Po dekarboksylacji lizyny powstaje diamina (kadaweryna) i dwutlenek węgla.

Dekarboksylacja zachodzi w obecności koenzymu fosforanu pirydoksalu. Ta reakcja jest nieodwracalna.

Wskaźnik pH (fiolet bromokrezolowy)

Wszystkie zmiany pH, które zachodzą w pożywce w wyniku różnych reakcji, są wykrywane przez purpurowy wskaźnik pH bromokrezolu.

W tym sensie, gdy występuje zakwaszenie, podłoże zmienia kolor na żółty, a gdy występuje alkalizacja, powraca do pierwotnego fioletowego lub fioletowego koloru.

Gdy następuje deaminacja lizyny z powodu obecności enzymu deaminazy lizynowej, na powierzchni tworzy się czerwonawy kolor, typowy dla rodzajów Proteus, Providencia i niektórych gatunków Morganella.

Wynika to z faktu, że podczas procesu deaminacji powstaje kwas alfa-keto-węglowy, który w obecności tlenu reaguje z cytrynianem amonu, co powoduje wspomnianą barwę.

Cytrynian żelazowo-amonowy i tiosiarczan sodu

Z drugiej strony, o bakteriach wytwarzających siarkowodór będzie świadczyć obecność tiosiarczanu sodu (źródło siarki) i cytrynianu amonu żelazowego, który jest wywoływaczem H ₂ S.

Bakterie, które mają enzym reduktazę tiosiarczanową, mają zdolność działania poprzez redukcję obecnego tiosiarczanu sodu, tworząc siarczyn i siarkowodór (H ₂ S).

Ten ostatni jest gazem bezbarwnym, ale reagując z solą żelaza tworzy siarczek żelazawy, który jest związkiem nierozpuszczalnym (widoczny czarny osad).

Jednakże, zdolność do tworzenia H ₂ S z tego podłoża jest bardzo niezawodny, ponieważ niektóre dekarboksylazy lizynowej ujemne bakterie wytwarzające H ₂ S nie tworzą czarny osad, gdyż kwasowość zakłóca średnich. Dlatego zaleca się sprawdzenie innych mediów zawierających żelazo.

Interpretacja testu

Dekarboksylacja lizyny

Probówki należy odczytać po 24 godzinach inkubacji, w przeciwnym razie istnieje ryzyko błędnej interpretacji reakcji, zgłaszając fałszywie ujemne wyniki.

Należy pamiętać, że pierwszą reakcją, jaka nastąpi, będzie fermentacja glukozy, dlatego wszystkie probówki po 10-12 godzinach zabarwiają się na żółto.

Jeśli pod koniec czasu inkubacji (24 godziny) obserwuje się żółte tło z fioletową lub fioletową powierzchnią, reakcja jest ujemna. Fioletowy kolor powierzchni odpowiada alkalizacji podłoża za pomocą peptonów.

Pozytywna reakcja to taka, w której dno i powierzchnia probówki są całkowicie fioletowe, to znaczy wraca do pierwotnego koloru.

Dlatego to, kto decyduje o pozytywności testu, jest podstawą lub tłem medium. W razie wątpliwości co do koloru można go porównać do nieinokulowanej probówki LIA.

Deaminacja lizyny

Rurka wykazująca deaminację lizyny będzie miała czerwonawo-bordową powierzchnię i żółte (kwaśne) tło lub cała rurka będzie miała czerwonawo-bordowy kolor.

Ta reakcja jest interpretowana jako negatywna dla dekarboksylacji lizyny, ale pozytywna dla deaminacji lizyny.

Ta reakcja jest zdefiniowana i zinterpretowana na ramce.

Produkcja siarkowodoru (H.

Pozytywną reakcję obserwuje się po pojawieniu się czarnego osadu w całości lub w części pożywki. Zwykle między krawędzią skosu a podstawą.

Jeśli osad pojawi się w całej rurce, nie ujawni innych reakcji, które zachodzą w środku.

Zapis wyników

Podczas interpretacji testu wyniki są zapisywane w następujący sposób:

Najpierw odczytuje się fazę, następnie dno lub blok, następnie produkcję H ₂ S, a na końcu produkcję gazu.

Przykład: K / A + (-). To znaczy:

• K: luneta alkaliczna (kolor fioletowy)
• A: Tło kwasowe (żółte), tj. Ujemna reakcja dekarboksylacji i ujemna deaminacja.
• +: Produkcja siarkowodoru
• (-): Bez gazu.

Przygotowanie

Odważyć 35 g odwodnionego podłoża agarowego z lizyną i rozpuścić w jednym litrze wody destylowanej.

Podgrzewaj, aż agar całkowicie się rozpuści, w tym celu gotuj przez minutę, często mieszając. Rozprowadzić 4 ml pożywki do probówek 13/100 z bawełnianymi zatyczkami.

Sterylizuj w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut. Wyjąć z autoklawu i odstawić pod kątem tak, aby była głęboka podstawa i krótki skos.

Przechowywać w lodówce 2-8 ° C. Pozwól mu się ogrzać przed wysianiem szczepu bakteryjnego.

Odwodnione podłoże ma kolor beżowy, a przygotowane podłoże czerwonawo-fioletowe.

Końcowe pH przygotowanej pożywki wynosi 6,7 ± 0,2

Pożywka zmienia kolor na żółty przy pH 5,2 lub niższym, a purpurowy przy pH 6,5 i wyższym.

Aplikacje

Test ten, wraz z innymi testami biochemicznymi, służy do identyfikacji pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae.

Pożywkę wysiewa się za pomocą prostej pętli lub igły, wykonuje się jedno lub dwa nakłucia na dnie probówki, a następnie powierzchnię podłoża nacina się zygzakiem.

Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 35-37 ° C w warunkach tlenowych. W razie potrzeby inkubuje się przez kolejne 24 godziny.

Przydatne jest głównie do różnicowania laktozo-ujemnych gatunków Citrobacter od Salmonellas sp.

Źródło: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.

Bibliografia

1. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne do identyfikacji bakterii o znaczeniu klinicznym. 3rd ed. Od redakcji Panamericana. Buenos Aires. Argentyna.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
4. Britannia Laboratories. Agar lizynowo-żelazowy. 2015 Dostępne pod adresem: britanialab.com
5. BD Laboratories. BBL Lysine Iron Agar Slants. 2007. Dostępne na: bd.com
6. Valtek Laboratories. Medium LIA 2009 Dostępne pod adresem: andinamedica.com