AGAR MÜELLERA HINTONA: PODSTAWA, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Mueller Hinton agar nie jest selektywny stałe pożywka składa się z mięsa, infuzji peptonu kazeiny kwasem skrobię, agar i woda destylowana. To podłoże umożliwia doskonały wzrost mikroorganizmów większości szybko rosnących bakterii.

Został pierwotnie stworzony przez Johna Howarda Müellera i Jane Hinton w celu wyizolowania bakterii wymagających żywienia, takich jak Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis. Jednak ze względu na swoje właściwości okazał się idealny do badania wrażliwości na antybiotyki, zapewniając wiarygodne i powtarzalne wyniki.

Antybiogramy (agar Müeller Hinton). Źródło: Dr Graham Beards na en.wikipedia

Dlatego agar Müeller Hinton jest pożywką hodowlaną zaakceptowaną przez Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) oraz European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, do przeprowadzania testu wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe metodą dyfuzji krążkowej Kirby'ego oraz Bauer.

Podstawa

Będąc nieselektywną pożywką, doskonale nadaje się do wzrostu większości bakterii chorobotwórczych.

Z drugiej strony jego prosty skład sprawia, że ​​substancje łatwo na nim dyfundują, co jest istotną cechą badania wrażliwości metodą dyfuzyjno-krążkową.

Inną jego cechą jest to, że zawiera niewielką ilość inhibitorów, co umożliwia skuteczną ocenę sulfonamidów, trimetoprimu i tetracyklin.

Należy jednak mieć na uwadze, że medium musi spełniać określone warunki, aby zapewnić jego prawidłowe funkcjonowanie, w tym:

Dostosowanie pH, głębokości agaru i odpowiedniego stężenia tyminy, tymidyny, Ca ⁺⁺ , Mg ⁺⁺ i Zn ⁺⁺ .

Musisz również wiedzieć, że metodologia jest ustandaryzowana, dlatego wszystkie parametry muszą być spełnione, takie jak:

Stężenie inokulum, stężenie i konserwacja krążków z antybiotykiem, umieszczenie odpowiedniej liczby krążków na agarze, odległość między krążkami, strategiczne rozmieszczenie niektórych antybiotyków, atmosfera, temperatura i czas inkubacja.

Przygotowanie

Odważyć 37 g odwodnionej pożywki Müeller Hinton i rozpuścić w 1 litrze wody destylowanej. Podgrzej pożywkę, mieszając, aby ułatwić rozpuszczenie. Gotować przez 1 minutę.

Autoklawuj do sterylizacji w 121 ° C przez 15 minut. Podczas wyjmowania z autoklawu kolbę należy umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 50 ° C w celu ostygnięcia. Wlać 25 do 30 ml na sterylne szalki Petriego o średnicy 10 cm.

Płytki powinny mieć średnią grubość 4 mm (idealne), dopuszczalny jest zakres 3-5 mm.

Jeśli pożądane jest przygotowanie agaru z krwią przy użyciu agaru Müellera Hintona jako bazy, przed podaniem na płytki należy wlać 5% jałowej i odwłóknionej krwi jagnięcej.

Końcowe pH pożywki powinno wynosić od 7,2 do 7,4.

Zainwestuj i przechowuj w lodówce do momentu użycia. Przed użyciem odczekać, aż płytka osiągnie temperaturę pokojową.

Kolor przygotowanego podłoża to jasny beż.

Aplikacje

Służy do wykonywania antybiogramu lub testu wrażliwości na antybiotyki większości szybko rosnących, niewymagających patogenów.

Jeśli agar jest uzupełniony krwią, służy do przeprowadzania antybiogramów wymagających drobnoustrojów, takich jak m.in .: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis. Był również używany do izolowania Legionella pneumophila.

Technika antybiogramu

Przed wykonaniem antybiogramu należy przygotować roztwór bakteryjny odpowiadający 1,5 x ¹⁰⁸ komórek.

W tym celu pobiera się 3 do 4 kolonii czystej kultury i zawiesza w bulionie z tryptykazą sojową lub w bulionie Müellera Hintona, inkubuje przez 2 do 6 godzin, po czym stężenie dostosowuje się sterylnym roztworem soli, porównując go ze standardem Mac Farland 0,5%.

Jeśli są wymagającymi mikroorganizmami, kolonie można zawiesić bezpośrednio do stężenia 0,5% Mac Farland. Następnie płytkę Müeller Hinton wysiewa się wacikiem nasączonym przygotowanym roztworem bakterii.

W tym celu wymazówkę zanurza się w roztworze, a następnie usuwa się nadmiar płynu, naciskając na ścianki probówki. Zaraz potem wacik przesuwa się po całej powierzchni, nie pozostawiając żadnych nietkniętych miejsc, następnie płytkę lekko obraca się i ponownie wysiewa. Operację powtarza się jeszcze 2 razy.

Odstaw na 10 minut, a następnie włóż krążki z antybiotykiem sterylną szczypcami, pozostawiając między nimi 24 mm odstęp. Po umieszczeniu każdego krążka na agarze, lekko dociśnij każdy krążek kleszczami, aby upewnić się, że dobrze przylegają.

Po zakończeniu procesu płytkę odwraca się i inkubuje w temperaturze 35–37 ° C w aerobiozie przez 16–18 godzin. Jeśli jest to drobnoustrój wymagający, może wymagać mikroaerofilii, a jeśli antybiogram zawiera krążki oksacyliny, należy go odczytać po 24 godzinach.

Linijka służy do pomiaru średnicy każdej aureoli. Wyniki należy zapisać w mm. Następnie uzyskane wartości koreluje się z tabelami punktów odcięcia opublikowanymi w aktualnym podręczniku CLSI.

Pomiar halo hamującego. Źródło: USCDCP, Pixnio.com

Podać jako wrażliwe (S), pośrednie (I) lub odporne (R), zależnie od przypadku.

Antybiotyki dobierane są w zależności od izolowanego mikroorganizmu i rodzaju zakażenia, które wywołuje.

Czasami należy pamiętać o strategicznym rozmieszczeniu antybiotyków, aby ujawnić fenotypowe wzorce oporności.

Strategiczne umieszczenie krążka na agarze Müeller Hinton

W przypadku enterobakterii krążek kwasu klawulanowego należy umieścić na cefalosporynach III i IV generacji. Rozszerzenie w kształcie jajka wskazuje, że szczep jest producentem beta-laktamaz o rozszerzonym spektrum (ESBL). Oznacza to, że pacjent nie powinien być leczony żadnymi cefalosporynami.

Fenotypowa ekspresja produkcji beta-laktamazy o rozszerzonym spektrum (ESBL) w szczepie Escherichia coli. Źródło: Zdjęcie autorstwa mgr inż. Marielsa gil

W przypadku Staphylococcus ważne jest, aby umieścić krążek erytromycyny lub azytromycyny przed krążkiem z klindamycyną (test D).

Oporny halo w erytromycynie i spłaszczenie w halo klindamycyny wskazuje, że szczep posiada indukowaną przez szczep oporność na klindamycynę (ICR). Oznacza to, że leczenie klindamycyną nie będzie skuteczne.

Aby wyszukać indukowalne szczepy AMP C w Enterobacteriaceae i niektórych niefermentujących pałeczkach Gram-ujemnych, tazobaktan ceftazydym, cefoksytyna lub piperacylina są skierowane w stronę krążka imipenemu w odległości 27 mm.

Spłaszczona halo na jednym z dysków zwróconych w stronę imipenemu wskazuje na obecność indukowalnego AMP C.

W celu poszukiwania konstytutywnego C-AMP, krążek kloksacyliny 500 µg zostaje skierowany do ceftazydymu (30 µg) i cefotaksymu (30 µg) w odległości 25 mm. Poszerzone halo w którejkolwiek z cefalosporyn wskazuje na wynik dodatni.

Krążek kloksacyliny można również zastąpić krążkiem 9 mm z bibuły filtracyjnej Whatman nr 6 impregnowanej kwasem fenyloborowym (400 µg) w odległości 18 mm. Jest interpretowany tak samo jak poprzedni.

Wreszcie, w celu zbadania produkcji metalobetalaktamaz, szczególnie w Pseudomonas aeruginosa, stosuje się krążek impregnowany 10 µl kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA 750 µg) i kwasu tioglikolowego (SMA 300 µg), który jest konfrontowany z krążkami imipenem i meropenemem, w odległości 15 mm.

Wynik testu jest pozytywny, jeśli występuje poszerzenie halo imipenemu lub meropenemu w kierunku krążka EDTA / SMA. Wynik ten musi zostać potwierdzony przez zmodyfikowany test Hodge'a.

Metoda ta polega na zaszczepieniu szczepu Escherichia coli ATCC 25922 na płytce Müeller Hinton. Krążek z imipenemem umieszcza się na środku płytki, a następnie wykonuje się smugę od krążka do obrzeża z podejrzeniem szczepu P. aeruginosa. Na płytce można przetestować do 4 szczepów.

Wynik testu będzie pozytywny, jeśli wokół rozstępu znajduje się strefa zniekształcenia halo imipenemu.

Przyczyny błędnych wyników

- Słabo konserwowane krążki antybiotykowe mogą powodować fałszywą oporność. Na przykład krążek oksacyliny jest bardzo wrażliwy na zmiany temperatury.

- pH podłoża poniżej wskazanego (kwaśne) wytwarza mniejsze halo w aminoglikozydach i makrolidach (ryzyko fałszywej oporności) i większe halo w penicylinie, tetracyklinie i nowobiocynie (ryzyko fałszywej wrażliwości).

-Jeśli pH jest wyższe niż wskazane (zasadowe), efekty opisane powyżej są odwracane.

-Środki o wysokim stężeniu tyminy i tymidyny mają wpływ poprzez znaczne zmniejszenie hamujących halo sulfonamidów i trimetoprimu.

-Wysokie stężenia wapnia i magnezu powodują fałszywą oporność aminoglikozydów, polimyksyny B i tetracyklin na szczepy Pseudomonas aeruginosa.

-Niskie stężenia wapnia i magnezu powodują fałszywą wrażliwość aminoglikozydów, polimyksyny B i tetracyklin na szczepy Pseudomonas aeruginosa.

- Obecność cynku wpływa na wyniki krążków karbapenemowych (imipenem, meropenem i ertapenem).

-Grubość podłoża poniżej 3 mm daje fałszywe wyniki czułości, podczas gdy grubość powyżej 5 daje fałszywą oporność.

-Uruchomienie krążków w antybiogramie da zdeformowane aureole, ponieważ uwolnienie antybiotyków jest natychmiastowe.

- Bardzo słabe inokulum wpływa na wyniki, ponieważ nie będzie równomiernego lub zlewnego wzrostu w agarze, co jest warunkiem koniecznym do pomiaru aureoli hamowania, oprócz tego, że aureole mogą dawać większe niż normalnie.

-Ponadto załadowany inokula może dać aureole mniejsze niż normalnie.

- Nieprzestrzeganie odległości między płytami powoduje, że jedna aureola nakłada się na drugą i nie można ich poprawnie odczytać.

-Incubate z CO ₂ zwiększa rozmiar halo krążków tetracykliny i metycyliny.

-Incubate w temperaturach poniżej 35 ° C wytwarza większe halo.

-Dodatek krwi zmniejsza rozmiar halo sulfamidu.

Ograniczenie

Wrażliwość antybiotyku wykazana w antybiogramie na drobnoustrój (in vitro) nie gwarantuje, że zadziała on in vivo.

QA

Aby wiedzieć, czy podłoże zawiera odpowiednią ilość tyminy, należy posadzić szczep Enterococcus faecalis ATCC 29212 i zbadać wrażliwość na trimetoprim sulfametoksazol (SXT), aby było zadowalające, musi dać halo równe lub> 20 mm.

Bibliografia

1. "Agar Müller-Hinton." Wikipedia, wolna encyklopedia. 16 listopada 2018 r., 12:23 UTC. 27 stycznia 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
3. Cona E. Warunki dobrego badania wrażliwości za pomocą testu dyfuzyjnego na agarze. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77–81
4. Laboratorium Difco Francisco Soria Melguizo. Agar Müeller Hinton z 5% krwi baraniej. 2009. Dostępne pod adresem: http://f-soria.es
5. Laboratorium BD Müeller Hinton II Agar Laboratory. Dostępne pod adresem: .bd.com
6. Britannia Laboratories. Agar Müellera Hintona. 2015 Dostępne pod adresem: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
8. Martínez-Rojas D. Betalaktamazy typu AmpC: Ogólne zagadnienia i metody wykrywania fenotypowego. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78–83. Dostępne pod adresem: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Fenotypic detekcja metalobetalaktamaz w izolatach klinicznych Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Dostępne pod adresem: scielo.org.