AGAR TSI: UZASADNIENIE, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Agar TSI lub potrójne agar cukier żelazo jest stałe podłoże, które służy do biochemicznych badań na przewodnik po początkowej identyfikacji bakterii Gram ujemnych. Opiera się na pokazaniu fermentacji obecnych cukrów oraz produkcji siarkowodoru i gazu.

Jego skład i podstawa są bardzo podobne do testu żelazowego Kliglera, z tą różnicą, że ten ostatni zawiera tylko glukozę i laktozę. Zamiast tego - jak sama nazwa wskazuje - agar z potrójnym cukrem i żelazem zawiera trzy ulegające fermentacji węglowodany: glukozę, laktozę i sacharozę.

Obrazy z testu TSI z różnymi mikroorganizmami A. Escherichia coli, B. Shigella flexneri, C) Salmonella typhimurium, D. Pseudomonas aeruginosa. Źródło: Witmadrid, źródło Wikimedia Commons

Ponadto podłoże TSI zawiera cztery pochodne białek, które czynią z niego bardzo pożywny agar: ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny, pepton i pepton proteozowy. Zawiera również żelazawy siarczan amonu, tiosiarczan sodu, chlorek sodu, czerwień fenolową i agar.

Niezdolność mikroorganizmu do fermentacji glukozy obecnej w pożywce natychmiast wyklucza go z przynależności do rodziny Enterobacteriaceae. Dlatego ten test jest niezbędny przy podejmowaniu decyzji, którą drogę identyfikacji wybrać w celu określenia rodzaju i gatunku.

Każde laboratorium decyduje, czy pracować z agarem TSI, czy z agarem żelaznym Kliglera.

Podstawa

Każdy ze związków pełni w medium jakąś funkcję.

Chlorek sodu i agar

Chlorek sodu jest niezbędny do utrzymania równowagi osmotycznej pożywki. Podczas gdy agar daje stałą konsystencję.

Wskaźnik pH (czerwień fenolowa)

PH przygotowanej pożywki jest zrównoważone i wynosi 7,3, a wskaźnik pH (czerwień fenolowa) zmienia kolor na żółty poniżej 6,8. Oznacza to, że niewielkie ilości kwasów wytwarzanych w procesie fermentacji cukrów zmieniają pożywkę z czerwono-pomarańczowej na żółtą.

Jeśli fermentacja nie nastąpi, nastąpi alkalizacja pożywki poprzez użycie peptonów, zmieniając kolor z czerwono-pomarańczowego na mocno czerwony.

Pochodne białka (wyciąg z drożdży, wyciąg z mięsa, pepton i pepton proteozy)

Kiedy bakterie metabolizują białka obecne w agarze TSI, wytwarzane są aminy, które alkalizują podłoże (głównie na poziomie fazowania), ponieważ reakcja wymaga tlenu. Aminy powodują, że oprawa jest jaskrawoczerwona.

Ale będzie to zależeć od zdolności bakterii do fermentacji węglowodanów.

Fermentacja węglowodanów (glukozy, laktozy i sacharozy)

Badanie fermentacji cukrów może dać kilka obrazów, a każdy z nich jest inaczej interpretowany. Interpretacja testu dzieli mikroorganizmy na 3 kategorie: produkty niefermentujące glukozy, produkty niefermentujące laktozy i fermentatory laktozy / sacharozy.

Należy zaznaczyć, że ilość glukozy w pożywce jest ograniczona, natomiast stężenie laktozy i sacharozy jest 10-krotnie wyższe.

Bakterie z rodziny Enterobacteriaceae i inne mikroorganizmy powodujące fermentację glukozy zaczną fermentować ten cukier, ponieważ jest to najprostszy węglowodan energetyczny.

Z drugiej strony laktoza i sacharoza to węglowodany złożone, które muszą zostać rozbite i przekształcone w glukozę, aby mogły wejść w cykl Embdena-Meyerhofa.

-Mikroorganizmy niefermentujące glukozy

Kiedy zaszczepiony mikroorganizm nie jest w stanie fermentować glukozy, znacznie mniej będzie w stanie fermentować innych węglowodanów. Dlatego nie powstają tu kwasy, ale w skosie powstają aminy przez użycie peptonów.

W takim przypadku ramka zmienia kolor na bardziej czerwony, a spód tubusu może pozostać niezmieniony lub też może zostać zalkalizowany, pozostawiając cały tubus czerwony.

Interpretacja: K / K oznacza zasadowe ukosowanie / zasadowe lub obojętne dno

Na zdjęciu na początku artykułu zobacz zdjęcie rury D.

Wynik ten wskazuje, że mikroorganizm nie należy do rodziny Enterobacteriaceae.

-Mikroorganizmy niefermentujące laktozy / sacharozy

Jeśli bakterie są w stanie fermentować glukozę, ale nie laktozę lub sacharozę, nastąpi:

Bakterie będą zużywać całą obecną glukozę po około 6 do 8 godzinach, będąc w stanie zakwaszać zarówno fazę, jak i blok; to znaczy, agar całkowicie zmieni kolor na żółty. Ale kiedy poziom glukozy się wyczerpie i nie można zastosować laktozy i sacharozy, bakterie rozpoczną metabolizm białek.

Ta reakcja wymaga tlenu, dlatego na powierzchni następuje degradacja peptonów (faza). Wytworzone aminy alkalizują ramkę, zmieniając kolor z żółtego na czerwony. Ta reakcja jest widoczna po 18 do 24 godzinach inkubacji.

Interpretacja: K / A oznacza fazę alkaliczną i zwitek kwasowy.

Na ilustracji na początku artykułu zobacz zdjęcie rury B.

- Mikroorganizmy powodujące fermentację laktozy / sacharozy

Mikroorganizmy zdolne do fermentacji laktozy i sacharozy mogą oczywiście fermentować glukozę. Po zużyciu minimalnej ilości glukozy obecnej w pożywce, utworzony pirogronian zaczyna metabolizować do kwasów w tlenowym cyklu Krebsa i po upływie 8 do 12 godzin całe podłoże będzie żółte.

Jeśli bakterie są w stanie rozłożyć laktozę lub sacharozę, kwasy będą nadal wytwarzane, a po 18–24 godzinach cała probówka - skos i korek - będzie nadal żółknąć.

Należy zauważyć, że glukozę stosuje się na dwa sposoby: jeden tlenowy na skosie probówki, a drugi beztlenowy na dnie probówki.

Interpretacja: A / A oznacza fazę kwasową / dno kwasowe. Może zawierać gaz lub nie.

Na ilustracji na początku artykułu zobacz ilustrację rury A.

Produkcja gazu

Niektóre mikroorganizmy są zdolne do wytwarzania gazu podczas fermentacji cukrów. Obecność gazu w probówce jest potwierdzona przez ciśnienie, jakie wywiera w agarze. Ciśnienie powoduje tworzenie się pęcherzyków lub przemieszczanie agaru. Czasami tworzenie się gazu może spowodować pęknięcie medium.

Ważne jest, aby w czasie wysiewu pożywki TSI nakłuć czysto środek agaru, aż sięgnie dna. Jeśli nakłucie zostanie skierowane w stronę ścianek rurki, może to spowodować fałszywe alarmy w produkcji gazu, ponieważ wydostanie się on przez źle uformowany kanał.

Produkcja gazu, jak również reakcje zachodzące w skosie agarowym wymagają tlenu, dlatego zaleca się, aby probówkę przykryć bawełnianą zatyczką, a jeśli używana jest nasadka bakelitowa, nie powinna być całkowicie szczelna.

Produkcja gazu jest zgłaszana jako dodatnia (+) lub ujemna (-).

Wzorce tworzenia się gazów. Źródło: Schemat przygotowany przez mgr inż. Marielsa Gil. Źródło obrazu: VeeDunnFlickr.com/Y_tambe, za Wikimedia Commons

Tiosiarczan sodu i siarczan żelazowo-amonowy

Bakterie zdolne do wytwarzania siarkowodoru (bezbarwnego gazu) pobierają siarkę z tiosiarczanu sodu obecnego w pożywce. Po H ₂ S utworzona reaguje z siarczanem amonu, żelaza, tworząc siarczek żelaza (widoczny czarny osad).

H ₂ produkcja S jako dodatnie (+) i ujemny (-).

Na obrazku na początku artykułu zobacz ilustrację rury C.

Przygotowanie

Odważyć 62,5 g odwodnionego agaru z potrójnym cukrem i żelazem (TSI) i rozpuścić w jednym litrze wody destylowanej.

Ogrzewać, aż agar całkowicie się rozpuści. Gotować przez minutę, często mieszając. Rozprowadzić 4 ml pożywki do probówek 13/100 z bawełnianymi zatyczkami.

Sterylizuj w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut. Wyjąć z autoklawu i odstawić pod kątem. Należy uważać, aby zarówno podstawa, jak i maskownica znajdowały się w tej samej odległości.

Przechowywać w lodówce 2-8 ° C. Pozwól mu się ogrzać przed wysianiem szczepu bakteryjnego.

Odwodnione podłoże ma kolor jasnobeżowy, a przygotowane podłoże czerwono-pomarańczowe.

Końcowe pH przygotowanej pożywki wynosi 7,3 ± 0,2.

Aplikacje

Test TSI jest szeroko stosowany na poziomie laboratoriów mikrobiologicznych. Ten test ma zasadnicze znaczenie dla określenia rodzaju testu, który należy zastosować w celu zidentyfikowania rodzaju i gatunku. Jego dobre wykonanie i interpretacja może zaoszczędzić materiał i pracę.

Jeżeli wynik to TSI K / K, a test oksydazy cytochromowej jest pozytywny, wiadomo, że testy powinny być stosowane do identyfikacji niefermentujących pałeczek Gram-ujemnych, takich jak między innymi Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Burkholderia. Jeśli jest oksydazo-ujemny, jest zorientowany na rodzaje Acinetobacter, Stenotrophomonas itp.

Z drugiej strony, jeśli uzyskamy TSI A / A lub K / A i wynik testu oksydazy cytochromowej jest ujemny, im więcej azotanów zostanie zredukowanych do azotynów, będziemy mieć pewność, że jest to mikroorganizm należący do rodziny Enterobacteriaceae. W tym przypadku droga identyfikacji skupi się na konkretnych testach dla tej grupy bakterii.

Z drugiej strony, jeśli uzyskany zostanie obraz K / A lub A / A i wynik testu oksydazy cytochromowej będzie pozytywny, dodatkowe testy, które zostaną zebrane, będą miały na celu identyfikację fermentujących szczepów, które nie należą do rodziny Enterobacteriaceae, takich jak: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio i Pasteurella.

TSI z siarkowodorem, oksydazo-ujemnym, będzie wskazówką do identyfikacji następujących rodzajów z rodziny Enterobacteriaceae: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella lub Salmonella.

Z TSI z niewielkim lub umiarkowanym siarkowodoru w zasadowym skosu alkalicznym tle i pozytywny oksydazy poprowadzi stosowanie testów do identyfikacji niefermentujące H _2. S- produkcji Gram-ujemnych, prętów, takich jak Shewanella putrefaciens.

Wreszcie TSI może być wykorzystana do badania produkcji siarkowodoru przez pałeczki Gram-dodatnie, zwłaszcza w przypadku podejrzenia Erysipelothrix rhusiopathiae.

Posiany

Podłoże TSI musi być zaszczepione czystymi koloniami, wyizolowanymi w kulturach pierwotnych lub selektywnych. Jeśli kolonia jest pobierana z pożywek selekcyjnych, które były wysiane próbkami z mieszaną florą, należy uważać, aby pobierać tylko z powierzchni, ponieważ żywe szczepy hamowane w tej pożywce mogą występować w dolnej części kolonii.

Dlatego pętli nigdy nie należy chłodzić na pożywce selektywnej, a następnie pobierać kolonię i zaszczepić pożywką TSI.

Siew będzie wykonywany za pomocą prostej pętli lub igły. Wykonane zostanie nakłucie, uważając, aby przechodziło przez środek środka aż do osiągnięcia dna, a następnie wysiew kończy się zaszczepieniem powierzchni w kształcie zygzaka. Nie rób dwóch nakłuć.

Inkubować w 37 ° C w aerobiozie przez 18-24 godzin. Dokonuj interpretacji w tym czasie, ani przed, ani po.

Ograniczenia

Test TSI należy odczytać w ciągu 18–24 godzin od inkubacji. Odczyt przed tym czasem może dać fałszywie pozytywny wynik dla fermentacji A / A. Zważywszy, że odczyt po tym czasie może spowodować fałszywie ujemny obraz urządzenia niefermentującego, ze względu na zużycie peptonów, które alkalizują pożywkę.

Bibliografia

1. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne do identyfikacji bakterii o znaczeniu klinicznym. 3rd ed. Od redakcji Panamericana. Buenos Aires. Argentyna.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
4. „TSI agar”. Wikipedia, wolna encyklopedia. 10 lipca 2018, 08:09 UTC. 10 lutego 2019, 03:33 Dostępne pod adresem: es.wikipedia.org
5. Britannia Laboratories. TSI Agar (agar z potrójnym cukrem i żelazem). 2015 Dostępne pod adresem: britanialab.com
6. BD Laboratories. Agar z potrójnym cukrem i żelazem (TSI Agar). 2003, dostępne pod adresem: bd.com