BULION MOCZNIKOWY: PODKŁAD, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIE - BIOLOGIA - 2026

Bulion mocznik jest cieczą pożywkę hodowlaną, która służy do wykrywania obecności enzymu ureazy w niektórych mikroorganizmów. Ureaza jest enzymem drobnoustrojowym, który jest wytwarzany w sposób konstytutywny, to znaczy jest syntetyzowany niezależnie od tego, czy obecny jest substrat, na który działa.

Funkcja ureazy jest związana z rozkładem związków organicznych. Nie wszystkie mikroorganizmy są zdolne do syntetyzowania tego enzymu, dlatego jego oznaczenie laboratoryjne pozwala na identyfikację określonych szczepów bakterii, a nawet rozróżnienie gatunków z tego samego rodzaju.

Ujemny i dodatni test mocznika. Źródło: Zdjęcie autorstwa mgr inż. Marielsa Gil.

Istnieją dwa rodzaje testów mocznika: Stuart i Christensen. Różnią się składem i wrażliwością. Pierwsza jest szczególna, ponieważ pokazuje dużą ilość ureazy wytwarzanej przez gatunki z rodzaju Proteus.

Drugi jest bardziej czuły i może wykryć niewielkie ilości ureazy wytwarzanej późno przez inne rodzaje bakterii, takie jak Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter i Mycobacterium.

Bulion mocznikowy Stuarta składa się z mocznika, chlorku sodu, fosforanu dwupotasowego, fosforanu monopotasu, ekstraktu drożdżowego, czerwieni fenolowej i wody destylowanej.

W międzyczasie bulion mocznikowy Christensena lub agar składa się z peptonów, chlorku sodu, fosforanu monopotasu, glukozy, mocznika, czerwieni fenolowej, wody destylowanej i agaru. Ta ostatnia tylko wtedy, gdy jest to medium stałe.

Podstawa

Enzym ureaza hydrolizuje mocznik, tworząc dwutlenek węgla, wodę i dwie cząsteczki amoniaku. Związki te reagują, tworząc produkt końcowy zwany węglanem amonu.

Bulion mocznikowy Stuarta

Bulion mocznikowy Stuarta jest bardziej buforowany i ma pH 6,8. Dlatego mikroorganizm musi być w stanie wytworzyć duże ilości amoniaku, aby zmienić kolor na czerwony fenolowy. PH powinno wzrosnąć powyżej 8.

Dlatego bulion mocznikowy Stuarta jest selektywny dla gatunków Proteus, dając pozytywne wyniki w ciągu 24 do 48 godzin od inkubacji i nie jest skuteczny w przypadku bakterii wytwarzających małe ilości ureazy lub wolno hydrolizujących mocznik.

Dzieje się tak, ponieważ gatunki Proteus mogą wykorzystywać mocznik jako źródło azotu. Zamiast tego inne bakterie wytwarzające ureazę potrzebują dodatkowego źródła.

Jednak Pérez i wsp. (2002) ustalili, że bulion mocznikowy Stuarta był równie skuteczny jak agar mocznikowy Christensena w oznaczaniu ureazy w szczepach drożdży z rodzajów Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon i Saccharomyces.

Autorzy badania twierdzą, że osiągnęli 100% zgodność z oboma mediami (Stuart i Christensen) podczas inkubacji przez 24 i 48 godzin; z wyjątkiem tego, że szczepy, którym udało się zmienić pożywkę na mocny różowo-fuksjowy kolor, uznano za pozytywne.

To wyjaśnienie jest konieczne, ponieważ Lodder (1970) stwierdził, że prawie wszystkim drożdżom udaje się zmienić fazę agaru mocznikowego Christensena na blady róż. Wynika to z faktu, że mogą one hydrolizować mocznik w minimalnych ilościach oraz powstawać amin poprzez oksydacyjną dekarboksylację aminokwasów na powierzchni. Nie należy tego interpretować jako pozytywnego.

Agar lub bulion mocznikowy Christensena

Bulion mocznikowy lub agar Christensena są mniej zbuforowane, dzięki czemu są w stanie wykryć niewielkie ilości amoniaku. Ponadto pożywka ta jest wzbogacona w peptony i glukozę. Związki te powodują wzrost innych mikroorganizmów wytwarzających ureazę, które nie rosną w bulionie Stuarta.

Podobnie, test mocznika Christensena daje szybsze wyniki, szczególnie w przypadku Proteusa, będąc w stanie dać silnie dodatni wynik w zaledwie 30 minut jako minimalny czas i do 6 godzin jako maksymalny czas.

Pozostałym mikroorganizmom wytwarzającym ureazę udaje się lekko zmienić kolor pożywki po 6 godzinach, a silnie po 24, 48, 72 godzinach lub więcej, a nawet niektóre szczepy mogą dawać słabe reakcje po 5 lub 6 dniach.

Interpretacja obu mediów (Stuart i Christensen)

Podłoże jest pierwotnie koloru żółto-pomarańczowego, a pozytywna reakcja zmieni kolor podłoża na różowo-fuksjowy. Intensywność koloru jest wprost proporcjonalna do ilości wytworzonego amoniaku.

Ujemna reakcja pozostawi podłoże w oryginalnym kolorze, z wyjątkiem drożdży, które mogą stać się bladoróżowe na podłożu agarowym Christensena z mocznikiem.

Przygotowanie

Bulion mocznikowy Stuarta

Zważyć niezbędne gramy zgodnie ze wskazówkami firmy handlowej. Rozpuścić w najlepiej sterylnej wodzie destylowanej. Nie używaj ciepła do rozpuszczenia, ponieważ mocznik jest wrażliwy na ciepło.

Do sterylizacji stosuje się filtrację membranową. W tym celu stosuje się filtr Millipore z porami o średnicy 0,45 µ. Nie używać autoklawu. Po przefiltrowaniu roztworu rozprowadza się go do sterylnych probówek. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, należy przenieść między 1,5 ml jako minimalną ilość a 3 ml jako maksymalną ilość na probówkę.

Przed użyciem przechowywać w lodówce i ogrzać.

Jeśli metoda filtracji nie jest dostępna, pożywkę należy natychmiast zużyć, aby uzyskać wiarygodne wyniki.

Inny sposób przygotowania bulionu mocznikowego Stuarta jest następujący:

Niektóre domy handlowe sprzedają podłoże podstawowe do testu mocznika, z wyłączeniem mocznika.

Waży się ilość wskazaną przez firmę handlową. Rozpuszcza się go w wodzie destylowanej i sterylizuje w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut. Odstawia się na chwilę, a gdy podłoże jest ciepłe, dodać 100 ml 20% roztworu mocznika i wysterylizować przez filtrację.

Jest rozprowadzany w sterylnych probówkach, jak opisano wcześniej.

Agar lub bulion mocznikowy Christensena

-Przygotowanie roztworu mocznika

Odważyć 29 g odwodnionego mocznika i rozpuścić w 100 ml wody destylowanej. Do sterylizacji użyj metody filtracji. Nie autoklawować.

- Agar na bazie mocznika

Rozpuścić 24 g odwodnionego podstawowego agaru w 950 ml wody destylowanej. Sterylizuj w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut. Odstawić do momentu osiągnięcia temperatury 50 ° C i dodać aseptycznie przygotowany wcześniej mocznik.

Wlać 4-5 ml do sterylnych probówek i przechylić do zestalenia. Powinien być długi dziób fletowy.

Pożywkę tę można również przygotować w postaci płynnej.

Aplikacje

Test mocznika jest niezwykle skuteczny w rozróżnianiu rodzaju Proteus od innych rodzajów z rodziny Enterobacteriaceae, biorąc pod uwagę szybką reakcję zapewnianą przez Proteus.

Wykorzystując kompozycję Christensena, test pomaga rozróżnić gatunki tego samego rodzaju. Na przykład S. haemolyticus i S. warneri są koagulazo-ujemne i beta-hemolityczne Staphylococcus, ale różnią się tym, że S. haemolyticus jest mocznik-ujemny, a S. warneri jest mocznik-dodatni.

Z drugiej strony McNulty z powodzeniem zastosował 2% bulion mocznikowy Christensena do badania obecności Helicobacter pylori w próbkach biopsji pobranych z błony śluzowej żołądka (okolica antralna).

O obecności H. pylori świadczy dodatni wynik testu mocznika. Czas obserwacji wyników jest wprost proporcjonalny do ilości obecnych mikroorganizmów.

Jak widać, jest to prosta metoda diagnostyki Helicobacter pylori w biopsjach żołądka.

Wreszcie test ten jest również przydatny do różnicowania gatunków z rodzajów Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus i Mycobacteria.

Wysiew test mocznika

Obie metody wymagają silnego inokulum mikrobiologicznego, aby zoptymalizować wyniki. Kolonie bakterii najlepiej pobierać z agaru z krwią, a drożdże z agaru Sabouraud, z kilkoma wyjątkami. Inokulum emulguje się w ciekłym medium.

W przypadku bulionu mocznikowego Stuarta inkubuj w temperaturze 37 ° C przez 24 do 48 godzin, wiedząc, że szukasz szczepów Proteus tylko wtedy, gdy szczepem jest bakteria. W przypadku drożdży można go inkubować w temperaturze 37 ° C lub w temperaturze pokojowej przez 24–48 godzin inkubacji.

W przypadku bulionu mocznikowego Christensena inkubuje się go w temperaturze 37 ° C przez 24 godziny. Jeśli wynik testu jest negatywny, można go inkubować do 6 dni. Pozytywny wynik testu przed upływem 6 godzin oznacza, że ​​jest to szczep z rodzaju Proteus.

W przypadku agaru mocznikowego Christensena, fazę agaru zaszczepia się silnie, bez przebijania. Bulion jest inkubowany i interpretowany w ten sam sposób.

QA

Do testowania pożywki można zastosować szczepy kontrolne, takie jak Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 i Salmonella typhimurium. Pierwsze dwa powinny dać wyniki pozytywne, a dwa ostatnie wyniki negatywne.

Źródło: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.

Bibliografia

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. i wsp. Wykorzystanie bulionu mocznikowego Stuarta do testu ureazy, jako testu w diagnostyce drożdży. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136–140. Dostępne pod adresem: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne do identyfikacji bakterii o znaczeniu klinicznym. 3rd ed. Od redakcji Panamericana. Buenos Aires. Argentyna.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
5. Britannia Laboratories. Podłoże Christensena (baza agaru mocznikowego) 2015. Dostępne na stronie: britanialab.com