PROTEINAZA K: CHARAKTERYSTYKA, AKTYWNOŚĆ ENZYMATYCZNA, ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Proteinaza K jest enzymem, należące do grupy proteaz serynowych, a więc, że posiada w swojej środkowej katalitycznie aktywnego aminokwasu seryny i ma za zadanie rozerwanie wiązań peptydowych przez hydrolizę. Z kolei enzym ten należy do rodziny białek subtylizyny (peptydaza S8).

Proteinaza K ma masę cząsteczkową (MW) 28 900 daltonów i została wyizolowana po raz pierwszy w 1974 roku w ekstraktach z grzyba Engyodontium album, wcześniej znanego jako Tritirachium album Limber.

Struktura molekularna proteinazy K. Źródło: Lykchiniadis

Ma wysoką zdolność proteolityczną, przejawiającą się zdolnością do degradacji keratyny obecnej we włosach. Słowo keratyna w języku angielskim jest pisane jako „keratyna”, stąd nazwa „proteinaza K”.

Ze względu na dużą zdolność rozszczepiania natywnych białek enzym ten jest przydatny w różnych technikach biologii molekularnej. Służy głównie do izolowania i przygotowania kwasów nukleinowych o dużej masie cząsteczkowej (MW).

Proteinaza K działa poprzez uwalnianie jądrowego DNA, jednocześnie niszcząc białka oraz inaktywuje RNazy i DNazy, czyli eliminuje nukleazy w preparatach DNA i RNA.

Z drugiej strony zaobserwowano, że proteinaza K może hydrolizować niektóre zdenaturowane białka natywne, co wzbudziło zainteresowanie naukowców jej zastosowaniem w badaniach białek prionowych (PrPC).

Jednak pomimo ich wysokiej siły proteolitycznej istnieją białka, które są oporne na działanie proteinazy K. Wśród nich są niektóre nieprawidłowe białka zwane prionami (PrPSc), związane z pasażowalnymi encefalopatiami gąbczastymi.

Charakterystyka proteinazy K.

Proteinaza K ma trzeciorzędową strukturę składającą się z trzech warstw, z siedmiłańcuchowym arkuszem β umieszczonym między dwiema warstwami helis. Ponieważ należy do rodziny peptydaz S8, charakteryzuje się triadą katalityczną w miejscu aktywnym, której kolejność to (Asp, His i Ser), co odróżnia ją od innych rodzin peptydaz.

Enzym z grupy proteaz serynowych charakteryzuje się hydrolizą wiązań peptydowych bliskich grupie karboksylowej aminokwasów alifatycznych i aromatycznych.

Z drugiej strony jest zdolny do działania w obecności pewnych substancji korozyjnych, takich jak dodecylosiarczan sodu (SDS), Tris-HCL i EDTA, które pomagają w denaturacji białek, powodując utratę ich natywnej struktury.

Jest to wstępny etap przygotowania białek do techniki elektroforezy. Zakres pH, w którym działa proteinaza K, jest dość szeroki (2,0 do 12,0), z optymalnym pH między 7,5 a 12,0, a jej punkt izoelektryczny wynosi 8,9. Jak widać, działa w bardzo szerokim zakresie pH.

Inną cechą wyróżniającą proteinazę K jest jej stabilność w obecności wysokich temperatur (50 - 60 ° C).

Aktywność enzymatyczna

Proteinaza K wymaga obecności jonu wapniowego, chociaż nie wpływa to na jej aktywność, jeśli konieczne jest utrzymanie jej stabilności.

Aby proteinaza K w pełni strawiła substrat, wymagany jest czas kontaktu wynoszący około 5 minut do 2 godzin.

Jednak w tym sensie Daza i wsp. Porównali czystość DNA otrzymanego w różnych momentach ekspozycji na proteinazę K i doszli do wniosku, że przedłużona inkubacja (do 24 godzin) znacząco poprawia jakość DNA.

Jednak w odniesieniu do stężenia enzymu proteinazy K stosowanego w różnych protokołach można powiedzieć, że jest ono bardzo zróżnicowane.

Może być stosowany od bardzo niskich stężeń (5 µg / ml) do stężeń 500 µg / ml. Jednak najbardziej powszechne stężenia robocze wahają się od 50–100 μg / ml, szczególnie w przypadku trawienia białek i inaktywacji nukleaz. Chociaż do leczenia tkanek wymagane jest stężenie 2 mg / ml.

Aplikacje

Jego zastosowania są bardzo szerokie i można je podsumować następująco:

-Służy do trawienia białek i ekstrakcji DNA różnymi metodami, takimi jak: wysalanie, PK-SDS, bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB), modyfikowany octan potasu oraz ekstrakcja jodkiem sodu.

-Inaktywacja nukleaz (RNazy i DNazy).

-W technice hybrydyzacji in situ (HIS), aby wspomóc uwalnianie kwasu nukleinowego, oprócz eliminacji niepożądanych białek.

-Modyfikacja białek.

-Na poziomie badawczym, w różnych badaniach.

Zalety proteinazy K.

Przeprowadzono kilka badań porównawczych między technikami ekstrakcji DNA, które wykorzystują proteinazę K, a innymi, które jej nie używają, i wszyscy stwierdzili, że stosowanie enzymu przynosi większe korzyści. Zalety obejmują:

-Uzyskuje się DNA o dużej masie cząsteczkowej, wysokiej jakości i czystości.

- Wyekstrahowany DNA jest stabilny do 3 miesięcy.

Wyekstrahowany DNA można wykorzystać między innymi w następujących technikach: Southern blot, łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR), elektroforeza.

Białka odporne na proteinazy K.

Różne badania wykazały, że priony (anormalne toksyczne białka PrPSc) różnią się od białek PrPC (natywnych) odpornością na działanie proteinazy K, podczas gdy PrPC są wrażliwe na jej działanie.

Inni autorzy opisali, że w strukturze PrPSc znajdują się części wrażliwe i inne odporne na proteinazę K. Jednak obie części są równie toksyczne i zakaźne.

Z drugiej strony Bastian i wsp. W 1987 roku wyizolowali 4 białka 28, 30, 66 i 76 kda z gatunku Spiroplasma mirum. Wszystkie okazały się odporne na działanie proteinazy K, a także wykazywały reakcję krzyżową z niektórymi prionami.

Wiadomo, że gatunek ten może powodować zaćmę i poważne uszkodzenia neurologiczne, a dzięki odkryciom naukowym Bastiana, między innymi badaniami, podjęto próbę powiązania tego mikroorganizmu z pasażowalnymi encefalopatiami gąbczastymi.

Jednak etiologię tej degeneracyjnej patologii neurologicznej nadal przypisuje się prionom.

W tym sensie Butler i wsp. W 1991 roku zidentyfikowali i scharakteryzowali klasę białek opornych na proteinazę K o masie 40 kda z dwóch szczepów Mycoplasma hyorhinis. Patogen ten atakuje świnie, infekując ich tkanki, ale w tym przypadku nie wystąpiła reakcja krzyżowa z badanymi prionami.

Konieczne są dalsze badania, aby wyjaśnić wiele niewiadomych w tym zakresie.

Bibliografia

1. Bastian F, Jennings R i Gardner W. 1987. Surowica przeciw białkom włókienkowym związanym ze scrapie reaguje krzyżowo z białkami włókienkowymi Spiroplasma miru m. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C, Guillen J, Rey J, Ruiz V. Ocena metody ekstrakcji i oczyszczania DNA z tkanki mięśniowej utrwalonej formaldehydem niezidentyfikowanych zwłok. Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E i Mcgarrity G. Identyfikacja i charakterystyka proteinazy K-Resistant Proteins in Members of the Class Mollicutes. Infection and Immunity, 1991,59 (3): 1037-1042
4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, i wsp. Porównanie dwóch protokołów ekstrakcji DNA Trypanosoma cruzi wyhodowanych na podłożu aksenicznym. Rev. Peru. Med. Exp. Zdrowie publiczne 2014; 31 (2): 222–227. Dostępne pod adresem: scielo.org
5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E i Palma W.Określenie skuteczności pięciu protokołów ekstrakcji DNA z materiału parafinowanego do badań molekularnych. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.