BARWIENIE KAPSUŁEK: UZASADNIENIE I TECHNIKI - BIOLOGIA - 2025

Kapsułka barwienia jest technika barwienia różnica który ma właściwość struktury stres polisacharydu otaczającą niektóre bakterie i drożdże zwane kapsułki. Jest stosowany w laboratoriach klinicznych, aby pomóc w diagnozowaniu niektórych patologii wywoływanych przez mikroorganizmy otoczkowe.

Jest również wykorzystywany w laboratoriach dydaktycznych do demonstrowania tej struktury morfologicznej studentom karier zawodowych m.in. medycyny, bioanalizy, pielęgniarstwa czy cytotechnologii.

Rozmaz Klebsiella pneumoniae barwiony plamą z kapsułek. Metoda tuszu indyjskiego z safraniną. Źródło: А.А.В

Istnieje kilka prostych technik wykazania obecności kapsułki w mikroorganizmach, które ją posiadają, są to: barwienie negatywne, barwienie Anthony'ego oraz wariant łączący dwa poprzednie.

Barwienie ujemne stosuje się głównie w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego, gdy podejrzewa się obecność drożdży Cryptococcus neoformans. Te drożdże są częstą przyczyną zapalenia opon mózgowych.

Technika ta wykorzystuje nigrozyna lub tusz indyjski i polega na stworzeniu kontrastu pomiędzy tłem preparatu a nieprzeniknioną otoczką mikroorganizmu. Tło staje się ciemne, a kapsułka jest bezbarwna. W ten sposób ujawnia się ta struktura.

Jeśli chodzi o technikę Anthony'ego, można powiedzieć, że jest ona stosowana głównie w laboratoriach do demonstrowania struktury polisacharydów bakterii, takich jak Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae i Neisseria meningitidis.

Zastosowanie tej techniki do celów diagnostycznych jest bardzo rzadkie, ponieważ istnieją inne rutynowe testy, które pozwalają na identyfikację tych mikroorganizmów.

Podstawa

Kapsułka jest silną strukturą o charakterze polisacharydowym. Chroni to mikroorganizmy przed fagocytozą, a zatem jest strukturą trudną do penetracji.

Dlatego plamy z kapsułek są oparte na kontraście. Barwniki plamią spód preparatu, podczas gdy kapsułka pozostaje bezbarwna.

Dlatego dzięki tym technikom kapsułka jest łatwo rozpoznawalna. Jeśli mikroorganizm nie będzie miał kapsułki, nie da się go rozróżnić przy tego typu zabarwieniu, ponieważ wszystko będzie poplamione tym samym kolorem.

Wszystkie techniki użyte do barwienia kapsułki mają to samo uzasadnienie, pomimo stosowania różnych barwników i procedur.

Techniki par

-Bejca antonowa

W plamie Anthony'ego zastosowano fiolet krystaliczny jako plamę. Spowoduje to zabarwienie ciała bakterii i tła na fioletowo.

Z drugiej strony stosuje się 20% siarczanu miedzi. Służy jako roztwór myjący, czyli usuwa nadmiar fioletowych kryształów z preparatu, sprawiając, że kapsułki stają się przezroczyste, ale bez ciałka bakterii lub utraty koloru tła.

materiały

- Opalizujące mleko.

- Ślizgać się.

- 1% fioletowego kryształu.

- 20% siarczanu miedzi.

- Mikroskop optyczny.

- Olejek immersyjny.

Proces

Ta technika składa się z:

1. Hoduj mikroorganizm w opalizującym mleku przez 36 godzin.
2. Umieść kroplę kultury na końcu szkiełka, a obok niej umieść kroplę fioletowego szkła, wymieszaj i rozprowadź końcem kolejnego szkiełka.
3. Wysuszyć na powietrzu i nie utwardzać.
4. Przemyć 20% roztworem siarczanu miedzi i pozostawić do wyschnięcia.
5. Obserwować pod mikroskopem z obiektywem immersyjnym. Szukaj w kierunku końcówek spreadu.

Ważne jest, aby nie używać ciepła ani do utrwalania, ani do suszenia, ponieważ powoduje to uszkodzenie kapsułki. Nie myć również wodą.

Interpretacja

Mleko opalizujące jest doskonałą pożywką hodowlaną, ponieważ dostarcza mikroorganizmowi niezbędnych składników odżywczych do wytworzenia widocznej kapsułki.

Z drugiej strony, opalizujące mleczko utworzy grube i zwarte dno, które wraz z ciałem bakterii będzie zabarwione na fioletowo, ale otoczka otaczająca mikroorganizm pozostanie bezbarwna. Dlatego wokół ciała bakterii obserwuje się wyraźne halo.

Graficzne przedstawienie na obserwacji mikroskopowej rozmazu Klebsiella pneumoniae zabarwionego plamą Anthony'ego. Źródło: Opracował mgr inż. Marielsa Gil.

Korzyść

Jest to prosta technika do wykonania. Nie wymaga mocowania.

Należy również zauważyć, że można stosować inne pożywki hodowlane, ale pożywka mleczna jest preferowana, ponieważ ma tę zaletę, że zapewnia bardziej widoczne kapsułki.

Niedogodności

Jest to technika nieco bardziej pracochłonna niż barwienie negatywowe, a jej wizualizacja wymaga odczekania do całkowitego wyschnięcia preparatu.

-Negatywne zabarwienie

materiały

- Slajdy.

- Pożywka z mikroorganizmem.

- Chiński atrament lub nigrozyna.

- Mikroskop optyczny.

- Fizjologiczny roztwór soli.

Proces

Umieścić kroplę soli fizjologicznej na szkiełku nakrywkowym i rozpuścić niewielką część kultury drobnoustrojów. Ważne, aby preparat nie był zbyt gęsty. Następnie umieść kroplę chińskiego atramentu lub nigrozyny i wymieszaj.

Następnie na preparat umieszcza się arkusz szkiełka nakrywkowego bez przelewania płynu. Obserwuje się go pod mikroskopem, najpierw skupiając się na obiektywie 10X, a następnie przesuwając do 40X.

Technika ta może być również stosowana bezpośrednio na próbkach CSF. Oznacza to, że zamiast umieszczać kroplę kultury drobnoustrojów, umieszcza się kroplę płynu mózgowo-rdzeniowego.

Korzyść

Jest to prosta metoda do wykonania i jednocześnie niedroga. Nie wymaga utrwalania ani suszenia preparatu.

Niedogodności

Wadą jest to, że trzeba to obserwować pod mikroskopem, zanim preparat wyschnie, gdyż w takim przypadku mikroorganizmy będą się kurczyć, co utrudni wizualizację.

Z drugiej strony, fałszywie dodatnie wyniki mogą wystąpić, jeśli analityk jest niedoświadczony, ponieważ leukocyty są często mylone z drożdżakami.

Obserwację torebek drożdżowych techniką tuszu chińskiego lub nigrozyny należy traktować jako wstępną diagnozę Cryptococcus neoformans, dopóki nie zostanie to wykazane w hodowli.

Dzieje się tak, ponieważ istnieją inne drożdżaki, które mogą być przyczyną zapalenia opon mózgowych, a nie tylko Cryptococcus neoformans, takie jak z rodzaju Candida i Rhodotorula, a także inne gatunki Cryptococcus.

Interpretacja

W przypadku mikroorganizmów otoczkowanych, obserwowane będzie ciemne tło z przezroczystymi ciałami unoszącymi się w cieczy, co podkreśla obecność kapsułki.

Kapsułka Cryptococcus neoformans barwiona chińskim atramentem. Źródło: Zdjęcie Źródło: Dostawcy treści: CDC / Dr. Leanor Haley

-Indyjska technika atramentowa

Ta technika może być również wykonana z nigrozyną. Jest to połączenie opisanych wcześniej technik. Ta technika wykorzystuje fiolet krystaliczny i atrament indyjski lub nigrozynę.

Ciało bakterii zmienia kolor na fioletowy od fioletu krystalicznego, ponieważ jest naładowany ujemnie, podczas gdy nigrozyna zabarwia spód rozmazu. Jeśli bakteria ma kapsułkę, pojawi się ona jako przezroczysta aureola wokół mikroorganizmu.

Fiolet krystaliczny można zastąpić dowolnym z kolorów: safraniną, podstawową fuksyną lub błękitem metylenowym.

materiały

- Fioletowe szkło.

- atrament nigrozynowy lub indyjski.

- Slajdy.

- Mikroskop.

Proces

- Hodować mikroorganizm w pożywce hodowlanej.

- Umieść kroplę kultury na końcu szkiełka, a obok niej umieść kroplę indyjskiego atramentu lub kryształu nigrozyny, wymieszaj i rozprowadź koniec kolejnego szkiełka.

- Wysuszyć na powietrzu i nie nagrzewać.

- Przykryć fioletowym roztworem kryształu na 1 minutę, przemyć wodą destylowaną, ale bardzo delikatnie (delikatny strumień), pozostawić do wyschnięcia na wolnym powietrzu.

- Obserwować pod mikroskopem przez obiektyw zanurzeniowy. Szukaj w kierunku końcówek spreadu.

Interpretacja

Widoczne będzie fioletowe ciało bakterii i ciemne tło. Kapsułka, jeśli jest obecna, będzie wyglądać na bezbarwną wokół bakterii.

Bibliografia

1. Covadonga A, Silóniz M, Serrano S. Podstawowe techniki mikrobiologii. Obserwacja bakterii. Reduca (biologia). Seria mikrobiologii. 2010; 3 (5): 15-38. re
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas R. Podstawowe barwienia w laboratorium mikrobiologicznym. Mediagraphic.org. 2014; 3 (1): 10-18. Dostępne pod adresem: medigraphic.com
3. Gil M. Barwienie negatywne: uzasadnienie, technika, zalety i wady. Lifeder.com.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentyna. Od redakcji Panamericana SA
5. Tankeshwar A. Barwienie kapsułki: zasada, procedura i wyniki. 2019. Poradnik mikrobiologii medycznej. Dostępne w: microbeonline.com