PLAMA WRIGHTA: UZASADNIENIE, MATERIAŁY, TECHNIKA I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2025

Wright plama jest techniką barwienia stworzony przez amerykańskiego patologa Jamesa Homera Wrighta w 1902 roku, oparty na plamę Romanowsky. Ponieważ plama Romanowsky'ego była niestabilna, Wright dodał metanol jako rozpuszczalnik i utrwalacz.

Zabarwienie to jest polichromatyczne, co oznacza, że ​​w zależności od struktury wchłaniającej barwnik generuje kilka kolorów. Ta technika barwienia jest szeroko stosowana do wykonywania różnicowych zliczeń białych krwinek oraz do badania morfologii czerwonych krwinek, płytek krwi i leukocytów we krwi obwodowej i szpiku kostnym.

Różne rozmazy krwi obwodowej poplamione plamą Wrighta. A. Ostra białaczka B. Plasmodium vivax w erytrocytach. C. Plasmodium falciparum, makrogametocyt. D. limfocytów

Jego zastosowanie jest bardzo ważne, ponieważ w różnych liniach komórkowych krwi można zaobserwować nieprawidłowości, co ułatwia diagnostykę chorób, takich jak białaczka czy infekcje bakteryjne lub pasożytnicze.

Być może są to najczęstsze aplikacje, w których wykorzystuje się tę technikę, ale nie jedyne. Jest również przydatny w próbkach innych niż krew i szpik kostny, takich jak między innymi wydzielina z nosa, śluz kałowy, plwocina, próbki skóry.

Uzasadnienie dla plamy Wrighta

Bejca Wrighta narodziła się z plamy Romanowskiego, która składa się z roztworu kwasu metylowego barwnika kwasowego (eozyny Y) i barwnika zasadowego (błękit metylenowy) oraz produktów ich utleniania w alkoholu metylowym.

Mieszanina barwników zastosowana w barwieniu Wrighta wywołuje efekt znany jako Romanowsky, czyli daje piękne fioletowe zabarwienie jądrom leukocytów i granulkom neutrofilowym, podczas gdy krwinki czerwone zabarwiają się na różowo.

Składnikami odpowiedzialnymi za nadanie typowej gamy kolorów barwnika Wrighta są niebieski B i eozyna Y. Obserwowany efekt będzie zależał od wiązania barwników ze strukturami chemicznymi oraz interakcji błękitu B i eozyny Y.

Struktury kwasowe, takie jak kwasy nukleinowe, białka jądrowe i reaktywne niedojrzałe cytoplazmy niektórych typów komórek, utrwalają niebieski B (barwnik zasadowy).

Podczas gdy podstawowe struktury, takie jak hemoglobina, granulki segmentowanych eozynofili, wśród innych struktur komórkowych, wiążą eozynę Y (barwnik kwasowy).

Na wynik barwienia mogą wpływać różne czynniki, takie jak pH barwnika Wrighta, bufor i roztwór do przemywania; jak również czas barwienia i utrwalania.

Dlatego każdy etap przygotowania odczynników jest kluczowy i musi być przeprowadzony z dbałością o każdy szczegół.

materiały

Plama Wrighta. Do 100 ml wymagane jest:

Odważ 0,3 g barwnika Wrighta, odmierz 97 ml metanolu i 3 ml glicerolu.

Przygotowanie

W moździerzu umieść dużą ilość barwnika Wrighta i stopniowo dodawaj glicerol, aż proszek całkowicie się rozpuści.

Następnie dodaje się metanol, miesza i wlewa do bursztynowej butelki.

Przed użyciem roztwór należy delikatnie wstrząsnąć i przefiltrować.

Buforowany roztwór buforowy

Do jednego litra wody destylowanej dodaje się 3,76 g hydrofosforanu disodowego (Na ₂ HPO ₄ 2H ₂ 0) oraz 2,1 g diwodorofosforanu potasu (KH ₂ PO ₄ ).

Bardzo dobrze wymieszaj, aż wszystkie włączone odczynniki zostaną rozpuszczone. Doprowadzić pH do 7,2. Wlej do szklanego słoika i trzymaj w temperaturze pokojowej.

Dodatkowe materiały potrzebne do wykonania kolorowania

Dodatkowo do wykonania techniki barwienia potrzebne są inne materiały, są to: szkiełka lub pokrowce do obiektów, mostek barwiący, koszulki z wodą lub buforem do prania, stoper do zapisywania czasów barwienia oraz trochę materiału suszącego (chłonny papier, gaza lub bawełna).

Składniki bejcy Wrighta

Metanol

Alkohol (metanol) służy jako utrwalacz rozmazu krwi na szkiełku.

Jest to po prostu koagulant redukujący, odwadniający i utrwalający. Dlatego jego funkcją jest koagulacja białek i uczynienie ich nierozpuszczalnymi, ale bez faktycznego ich denaturacji.

Metanol jest najczęściej stosowanym we wszystkich laboratoriach odczynnikiem utrwalającym rozmaz, ponieważ zapewnia lepsze wyniki niż etanol. Idealne stężenie to 99%.

Amortyzator

Bufor (roztwór buforowany) ma funkcję regulowania lub utrzymywania pH barwnika, ponieważ pH ustawione na 7,2 jest niezbędne, aby struktury komórkowe mogły prawidłowo wchłaniać barwniki.

Z drugiej strony, etap wiązania metanolu odwadnia komórki, a bufor pomaga je ponownie nawodnić.

Eozyna (Y)

Eozyna ma powinowactwo do bloków budulcowych, ponieważ jest barwnikiem kwasowym. Znane są dwa rodzaje eozyny, które są do siebie bardzo podobne, do tego stopnia, że ​​można użyć każdego z nich, uzyskując ten sam wynik.

Jedna nazywa się eozyną Y, żółtą eozyną lub tetrabromofluoresceiną, a drugą nazywa się eozyną B, niebieskawą erytrozyną B lub dibromodinitrofluoresceiną. Jednak najczęściej stosowana jest eozyna Y.

Najważniejszą właściwością tego barwnika jest jego ujemna polaryzacja, co sprawia, że ​​przyciąga on dodatnio naładowane struktury komórkowe.

Błękit metylenowy

To jest podstawowa kolorystyka. Jego główną właściwością jest metachromazja, czyli nie wszystkie struktury będą wybarwione na ten sam kolor, zależy to od składu chemicznego barwionych struktur.

Niektóre zmienią kolor na jasnoniebieski lub ciemnoniebieski, a inne na ciemnofioletowe lub bladoliliowe.

Technika

1-Rozprowadź próbkę tak, aby pozostała cienka warstwa na szkiełku lub szkiełku nakrywkowym.

2-Pozostawić do wyschnięcia na około 2 godziny.

3-Umieść suchy rozmaz na mostku barwiącym lub tacce do barwienia, tak aby rozprowadzona próbka była skierowana do góry.

4-Przykryj arkusz plamą Wright kropla po kropli, aż cała powierzchnia zostanie pokryta. Pozostaw na 5 - 8 minut.

5-Plama powinna całkowicie zakryć szkiełko, nie rozlewając się po krawędziach. Jeśli w czasie barwienia zacznie wyparowywać, dodaj kilka dodatkowych kropli.

6-Następnie dodaj taką samą ilość amortyzatora, lekko dmuchaj, aż pojawi się charakterystyczny metaliczny połysk. Czas od 10 do 15 minut.

7-Umyj wodą z kranu, delikatnym strumieniem, aż prześcieradło będzie różowe.

8-Gazą nasączoną alkoholem usuń barwnik przyklejony do tylnej części szkiełka.

9-Niech rozmaz wyschnie bardzo dobrze przed umieszczeniem olejku immersyjnego w celu obejrzenia go pod mikroskopem.

Użyteczność

Hematologia

Idealnie nadaje się do barwienia rozmazów krwi obwodowej, do badania rozmazów krwi grubej oraz do badania komórek z próbek szpiku kostnego.

Ze względu na właściwości chemiczne tej kombinacji barwników można łatwo rozpoznać struktury komórkowe i rozróżnić różne typy obecnych komórek.

Katar

Technika ta jest bardzo przydatna do identyfikacji komórek wydzieliny z nosa (komórki nabłonka, segmentowane eozynofile, komórki polimorfojądrowe) w diagnostyce alergicznego nieżytu nosa.

parazytologia

W tym sensie była przydatna do badania Leishmania sp w histiocytach podskórnej tkanki komórkowej w owrzodzeniach skóry. Służy również do identyfikacji leukocytów w próbkach kału (leukogram kału).

W takim przypadku lekarz powinien wiedzieć, czy leukocytoza obecna w kale jest polimorfojądrowa czy jednojądrzasta. To odkrycie w leukogramie kału wskaże, czy jest to odpowiednio infekcja bakteryjna czy wirusowa.

Z drugiej strony pasożyty krążące we krwi można znaleźć w erytrocytach lub w osoczu. Poszukiwanymi pasożytami są Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii i filariae, aw weterynarii jest to przydatne w poszukiwaniu Theileria equi i Babesia caballi, czynników wywołujących pebezjozę, zwłaszcza u koni.

Barwienie Wrighta, a także barwienie Giemsa pozwalają na odróżnienie hemopasożytów od normalnych składników komórkowych. Można do tego wykorzystać dwa rodzaje spreadów:

Rozprowadzić cienko

Krew rozprowadza się w postaci cienkiej warstwy na szkiełku. Jest barwiony barwnikiem Wrighta, odsłaniając cechy jądra i cytoplazmy.

Gruba kropla

Metodologia ta służy do badania obecności pasożytów w większej ilości krwi.

Aby to zrobić, na szkiełku umieszcza się dużą kroplę krwi. Tam należy go zdefibrylować, wykonując coraz większe okręgi od środka na zewnątrz, używając krawędzi innego szkiełka.

Wreszcie, aby móc obserwować pasożyty w gęstym rozmazie, erytrocyty muszą zostać poddane lizie wodą.

Infekcje dróg oddechowych

Na poziomie oddechowym technika ta jest również przydatna, ponieważ komórki obecne w próbkach plwociny, popłuczynach oskrzelowych lub oskrzelowo-pęcherzykowych są ważne dla ustalenia rozpoznania.

Podobnie można tutaj rozróżnić komórki polimorfojądrzaste i komórki jednojądrzaste.

Bakteriologia

Zastosowanie tej techniki w bakteriologii jest ograniczone, ponieważ nie nadaje się ona do barwienia bakterii, dlatego do ich barwienia stosuje się inne specjalistyczne techniki barwienia.

Jednak był on stosowany do poszukiwania komórek nabłonka z ciałkami inkluzyjnymi Chlamydia trachomatis w wymazach z błony śluzowej cewki moczowej lub szyjki macicy, chociaż należy uznać, że nie jest to najlepsza metoda.

Można również zaobserwować bakterie spiralne, takie jak Borrelia burgdorferi, wśród czerwonych krwinek u zakażonych pacjentów, a także morule lub ciałka inkluzyjne Ehrlichia sp w cytoplazmie limfocytów, monocytów lub neutrofili w rozmazie krwi.

Mikologia

Histoplasma capsulatum jest patogennym grzybem często rozpoznawanym przez obserwację mikroskopową różnych próbek tkanek, zabarwionych barwnikiem Wrighta.

Jak obserwuje się strukturę próbki krwi w plamie Wrighta?

Źródło: Retamales E, Mazo V. Institute of Public Health, Government of Chile. Zalecenia dotyczące barwienia rozmazów krwi do odczytu hemogramu.

Zalecenia dotyczące dobrego barwienia

Szkiełka z próbkami krwi powinny samoistnie wyschnąć na powietrzu. Smugi powinny być jak najcieńsze, aby uzyskać lepsze utrwalenie barwnika i uniknąć nadmiernego zabarwienia.

Aby uzyskać wysokiej jakości barwienie, zaleca się zabarwienie w ciągu dwóch godzin od przygotowania rozmazu. Z drugiej strony idealną próbką jest krew włośniczkowa, bez antykoagulantu.

Jeśli jednak używana jest krew żylna, powinna być stosowana jako antykoagulant EDTA, a nie heparyna, ponieważ ta ostatnia może deformować struktury komórkowe.

Aby uniknąć zepsucia przygotowanego barwnika, należy go przechowywać w suchych miejscach.

Podczas mycia zaleca się stosowanie wody o neutralnym pH.

Wreszcie wskazane jest od czasu do czasu przetestowanie metod barwienia stosowanych w laboratorium.

Odbywa się to poprzez barwienie próbek lub rozszerzone wzory, jako kontrola jakości. Ten krok jest ważny, ponieważ zapewnia prawidłowe przygotowanie barwienia i ustandaryzowanie czasów barwienia.

Jeśli arkusz wzoru jest słabo zabarwiony, występują problemy, które należy rozwiązać.

Typowe błędy w barwieniu Wrighta

Bardzo blade zabarwienie

Bardzo blade smugi są zwykle spowodowane bardzo krótkim czasem barwienia lub nadmiernym praniem. Korekta polega na wydłużeniu czasu kontaktu z barwnikiem lub skróceniu czasu prania.

Barwnik wytrąca się

Obecność wytrącania się barwnika w rozmazie może mieć kilka przyczyn, jednak najczęstszymi przyczynami są: stosowanie niefiltrowanego barwnika, plamienie na nierównych mostkach barwiących, stosowanie arkuszy zabrudzonych kurzem lub tłuszczem, słabe zmywanie całkowite zabarwienie.

Bardzo czerwona lub niebieska smuga

Bufor odpowiada za pH barwnika. Barwniki o pH poniżej wskazanego (kwaśne) spowodują bardzo czerwonawe rozmazania.

Jeśli pH barwnika jest powyżej (zasadowe), zostanie uzyskany bardzo niebieskawy rozmaz.

Tryb przechowywania

Odczynnik należy przechowywać w temperaturze pokojowej.

Bibliografia

1. Gutiérrez V. Badanie porównawcze metody barwienia Wrighta i testu Elisa do diagnozy psiej erlichiozy w mieście San Pedro Sula w Hondurasie. 2008. Praca dyplomowa uprawniająca do uzyskania tytułu lekarza weterynarii. Uniwersytet San Carlos w Gwatemali.
2. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Podstawowe barwienia w laboratorium mikrobiologicznym. Badania niepełnosprawności. 2014; 3 (1): 10-18.
3. "Plama Wrighta." Wikipedia, wolna encyklopedia. 18 maja 2018, 12:05 UTC. 8 grudnia 2018, 20:37
4. Calderón A, Cardona J, Vergara Ó. Częstość występowania Babesia spp. u koni myśliwskich, Córdoba (Kolumbia). Rev. udcaactual ujawniający. 2013; 16 (2): 451–458.
5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Argentyna. Od redakcji Panamericana SA
6. Retamales E, Mazo V. Institute of Public Health Government of Chile. Zalecenia dotyczące barwienia rozmazów krwi do odczytu hemogramu.