SIMMONS CITRATE AGAR: UZASADNIENIE, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIE - BIOLOGIA - 2026

Agar Simmons cytrynian to stałe podłoże stosuje się jako biochemicznych drobnoustrojów testowych identyfikacji, zwłaszcza gram - ujemnych. Oryginalne medium zostało stworzone przez Kosera w 1923 roku.

Podłoże Koser Citrate składało się z bulionu zawierającego fosforan sodu, fosforan amonu, fosforan monopotasu, siarczan magnezu i cytrynian sodu.

A. Odwodniona komercyjna pożywka agarowa z cytrynianem Simmonsa B. Przygotowany agar cytrynianowy Simmonsa. Źródło: A. Zdjęcie wykonane przez mgr inż. Marielsa Gil B. Roto2esdios, źródło Wikimedia Commons

Jak widać, jedynym źródłem węgla w pożywce jest cytrynian, a azotu fosforan amonu, pomijając białka i węglowodany jako źródło tych pierwiastków, są one powszechnie obecne w innych pożywkach.

Dlatego bakterie zaszczepione w tym podłożu mogą rozmnażać się tylko wtedy, gdy są zdolne do pobierania węgla z cytrynianu. Test był pozytywny, jeśli w pożywce było zmętnienie, jednak miał tę wadę, że mogło wystąpić zmętnienie niespecyficzne.

Problem ten został rozwiązany przez Simmonsa, dodając błękit bromotymolowy i agar do oryginalnej receptury Kosera. Chociaż zasada jest taka sama, jest różnie interpretowana.

Podstawa

Niektóre bakterie mają zdolność przetrwania w przypadku braku fermentacji lub produkcji kwasu mlekowego, wymagając pozyskiwania energii z innych substratów. W tym teście jedynym oferowanym źródłem węgla jest cytrynian.

Bakterie, które są w stanie przetrwać w tych warunkach, szybko metabolizują cytrynian alternatywnie do tradycyjnej drogi, wykorzystując cykl kwasu trikarboksylowego lub cykl fermentacji cytrynianu.

Katabolizm cytrynianu przez bakterie opiera się na mechanizmie enzymatycznym bez udziału koenzymu A. Enzym ten jest znany pod nazwą cytrynian (liaza cytrynianowo-szczawiooctanowa) lub desmolaza cytrynianowa. Reakcja wymaga obecności dwuwartościowego kationu, który w tym przypadku jest dostarczany przez magnez.

W wyniku reakcji powstaje szczawiooctan i pirogronian, które następnie powodują powstawanie kwasów organicznych w środku zasadowego pH utworzonego przy użyciu źródła azotu. Te kwasy organiczne są wykorzystywane jako źródło węgla wytwarzające węglany i wodorowęglany, dodatkowo alkalizujące środowisko.

Tryb siewu

Pożywkę cytrynianową Simmonsa należy lekko zaszczepić w fishtail przy użyciu prostej pętli lub igły i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 35-37 ° C. Po pewnym czasie wyniki są obserwowane.

Wysiew odbywa się tylko na powierzchni agaru. Nie przebijaj.

Interpretacja

Jeśli podłoże zachowuje pierwotny kolor (zielony) i nie ma widocznego wzrostu, wynik testu jest ujemny, ale jeśli podłoże zmieni kolor na niebieski, oznacza to obecność produktów alkalicznych, co jest wykrywane przez wskaźnik pH. W tym przypadku wynik testu jest pozytywny.

Cytrynian (+) i (-). Źródło: mgr inż. Marielsa gil

Dzieje się tak, ponieważ jeśli bakteria wykorzystuje węgiel cytrynianu, jest również zdolna do pobierania azotu z fosforanu amonu, z którym uwalnia amoniak, alkalizując podłoże.

Z drugiej strony, jeśli obserwuje się wzrost bakterii w pożywce, ale nie ma zmiany koloru, test również należy uznać za pozytywny, ponieważ jeśli występuje wzrost, oznacza to, że bakterie były w stanie wykorzystać cytrynian jako źródło węgla, chociaż w tej chwili nie ma zmiany pH (czasami może to zająć trochę czasu).

W przypadku jakichkolwiek wątpliwości w interpretacji ostatecznego koloru można go porównać do niezaszczepionej probówki z cytrynianem.

Przygotowanie

Odważyć 24,2 g odwodnionej pożywki na 1 litr wody. Wymieszaj i odstaw na około 5 minut. Zakończyć rozpuszczanie medium przez podgrzewanie przez 1 lub dwie minuty, często wstrząsając.

Wlać 4 ml do probówek i autoklawować w 121 ° C przez 15 minut. Wychodząc z autoklawu, przechylić za pomocą podpórki w taki sposób, aby agar zestalił się w kształcie dzioba w kształcie żłobka z niewielkim klockiem lub dnem i bardziej skośnym.

Końcowe pH pożywki cytrynianowej wynosi 6,9 (kolor zielony). To podłoże jest bardzo wrażliwe na zmiany pH.

Przy pH 6 lub niższym podłoże zmienia kolor na żółty. Tego koloru nie obserwuje się w teście bakteryjnym.

Przy pH 7,6 lub wyższym podłoże zmienia kolor na głęboki pruski błękit.

Posługiwać się

Simmons Citrate Agar jest używany do identyfikacji niektórych mikroorganizmów, zwłaszcza pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae i innych laseczek niefermentujących glukozy.

Źródło: Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.

Końcowe przemyślenia

Pożywka cytrynianowa Simmonsa jest bardzo delikatnym testem, ponieważ w przypadku popełnienia pewnych błędów można uzyskać fałszywie dodatnie wyniki.

Środki ostrożności, które należy zachować, są następujące:

Inokulum

Nie należy wykonywać bardzo gęstego lub obciążonego inokulum bakteryjnego, ponieważ może to spowodować pojawienie się miedziano-żółtego koloru w miejscu siewu, bez wpływu na resztę pożywki, ale może prowadzić do podejrzeń, że nastąpił wzrost. Nie oznacza to pozytywnego wyniku testu.

Podobnie gruby inokulum może generować fałszywie dodatni wynik, ponieważ wstępnie uformowane związki organiczne w ścianach komórkowych umierających bakterii mogą uwalniać wystarczającą ilość węgla i azotu, aby zmienić wskaźnik pH.

Dlatego najlepiej jest wysiewać przy użyciu igły zamiast platynowego uchwytu, aby uniknąć pobierania nadmiaru materiału.

Posiany

Z drugiej strony, gdy wysiewa się zestaw testów biochemicznych do identyfikacji danego mikroorganizmu, ważne jest, aby jako pierwszy zaszczepić test cytrynianowy, aby uniknąć przeniesienia białek lub węglowodanów z innego podłoża.

W tej sytuacji możliwe jest uzyskanie fałszywie dodatniego wyniku, ponieważ każda z tych substancji wprowadzona przez pomyłkę zostanie zmetabolizowana i spowoduje zmianę pH.

Innym sposobem uniknięcia przenoszenia substancji jest dobre wypalenie pętli i pobranie nowego inokulum między jednym a drugim testem.

Należy również zachować ostrożność podczas dotykania kolonii w celu wykonania inokulum, ponieważ należy unikać wyciągania części agaru z kultury, z której pochodzą bakterie, ze względu na powyższe wyjaśnienia.

W tym sensie Matsen, Sherris i Branson zalecają rozcieńczenie inokulum w roztworze fizjologicznym przed zaszczepieniem testu cytrynianowego, aby uniknąć przenoszenia innych źródeł węgla.

Intensywność koloru

Należy wziąć pod uwagę, że intensywność koloru uzyskanego po pozytywnym wyniku testu może się różnić w zależności od domu handlowego.

Ponadto istnieją mikroorganizmy, które dają wynik pozytywny po 24 godzinach, ale są też inne szczepy, które wymagają 48 godzin lub więcej, aby wywołać zmianę pH.

Bibliografia

1. Mac Faddin J. (2003). Testy biochemiczne do identyfikacji bakterii o znaczeniu klinicznym. 3rd ed. Od redakcji Panamericana. Buenos Aires. Argentyna.
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
4. BD Laboratories. BBL Simmons Citrate Agar Slants. 2015 Dostępne na: bd.com
5. Britannia Laboratories. Agar cytrynianowy Simmonsa. 2015 Dostępne pod adresem: britanialab.com
6. Laboratoria diagnostyczne Valtek. Agar cytrynianowy Simmonsa. 2016 Dostępne pod adresem: andinamedica.com.