STANDARDOWE KULKI AGAROWE: UZASADNIENIE, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Agaru średnia jest nie - selektywny pożywce stałej przeznaczone do ilościowego określania obciążenia mikrobiologicznego aerobowych w próbkach wody pitnej, ścieków, mleka, napojów i innych produktów spożywczych. Podłoże to jest również znane jako agar PCA, od akronimu w angielskim Plate Count Agar. Został stworzony w 1953 roku przez Buchbindera, Barisa i Goldsteina.

Standardowe podłoże agarowe składa się z ekstraktu drożdżowego, tripteiny, glukozy, agaru i wody destylowanej. Preparat zawiera podstawowe składniki odżywcze, które pozwalają na rozwój obecnego obciążenia drobnoustrojami tlenowymi, nie wymagającymi.

Dziesiętne rozcieńczenia do zliczania CFU w standardowym liczeniu na agarze. Źródło: Quentin Geissmann

Ponieważ podłoże nie zawiera inhibitorów, bakterie mogą rosnąć bez żadnych ograniczeń, co czyni je idealnym do ogólnego liczenia kolonii. Jednak technika ilościowego oznaczania łysinek nie wykryje wszystkich obecnych bakterii, ale tylko te, które są zdolne do wzrostu w warunkach środowiskowych, którym poddawany jest posiany agar z liczeniem standardowym.

W tym sensie technika ilościowego oznaczania płytek zasadniczo dąży do określenia ilości bakterii typu tlenowego mezofilnego, to znaczy takich, które rozwijają się w temperaturach od 25 do 40 ° C, przy optymalnej temperaturze wzrostu 37 ° C. .

Ta grupa bakterii jest bardzo ważna, ponieważ znajduje się tam większość bakterii chorobotwórczych dla człowieka.

Należy zauważyć, że czasami interesujące może być ilościowe określenie ilości bakterii psychrofilnych obecnych w żywności. Te bakterie to te, które rosną w niskich temperaturach (<20 ° C) i są odpowiedzialne za szybszy rozkład żywności, nawet w lodówce.

Podobnie bakterie termofilne, które rozwijają się w zakresie od 50 ° C do 80 ° C lub więcej, mogą być ważne w niektórych rodzajach żywności, takich jak żywność w puszkach.

Oznaczanie ilościowe drobnoustrojów jest wyrażane w jednostkach tworzących kolonie (CFU) na gram lub mililitr próbki.

Podstawa

Standardowa pożywka do zliczania została zaprojektowana tak, aby umożliwić pomyślny wzrost niewymagających wybrednych bakterii tlenowych, ponieważ ekstrakt drożdżowy, tripteina i glukoza dostarczają składników odżywczych niezbędnych do dobrego wzrostu mikroorganizmów.

Z drugiej strony podłoże ma jasny kolor i przezroczysty wygląd, dlatego idealnie nadaje się do wizualizacji kolonii wytworzonych metodą głębokiego wysiewu (odlewanie płytkowe).

Możliwe jest również zliczanie kolonii metodą wysiewu powierzchniowego szpatułki Drigalskiego.

Gdy ładunek drobnoustrojów jest wysoki, należy wykonać dziesiętne rozcieńczenia badanej próbki, aby można było policzyć CFU.

Należy zauważyć, że podłoże to jest zalecane przez Amerykańskie Stowarzyszenie Zdrowia Publicznego (APHA) do liczenia tlenowych mezofilów.

Przygotowanie

Odważyć 23,5 g odwodnionej pożywki i rozpuścić w litrze wody destylowanej. Aby całkowicie się rozpuścić, mieszaninę należy podgrzewać, często mieszając, aż do wrzenia. Późniejsze kroki zależą od zastosowanej techniki wysiewu.

Do techniki płytowej

Rozprowadzić, umieszczając 12–15 ml w probówkach. Następnie sterylizuj w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut. Pozwól zestalić się pionowo w kształcie bloku. Przechowywać w lodówce do momentu użycia.

Rozpuść wtyczkę, kiedy będziesz jej używać. Po stopieniu przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 44-47 ° C podczas przygotowywania próbek.

Do siewu powierzchniowego

Sterylizuj pożywkę w autoklawie w 121 ° C, a następnie rozprowadź 20 ml na sterylnych szalkach Petriego. Pozostaw do zestalenia, odwróć i przechowuj w lodówce do użycia.

Przed użyciem należy odpuścić płytki. PH pożywki powinno wynosić 7,0 ± 0,2.

Posługiwać się

Standard Count Agar jest stosowany w tlenowej technice liczenia mezofilnego podczas analizy mikrobiologicznej wody i żywności. Zliczenie mezofilów tlenowych jest konieczne, ponieważ decyduje o jakości sanitarnej badanej próbki.

Zastosowanie tej techniki (przy użyciu tego medium) pozwala na makroskopową wizualizację izolowanych kolonii w celu ich ilościowego oznaczenia.

Technika wysiewu płytowego (siew głęboki)

-Proces

Technika składa się z następujących elementów:

1) Homogenizuj próbkę, aby rozprowadzić obecne bakterie.

2) Wstępną zawiesinę sporządza się w sterylnej butelce lub woreczku, przestrzegając proporcji 10 gr lub 10 ml próbki w 90 ml rozcieńczalnika ( ^10-1 ).

3) Z początkowej zawiesiny sporządza się odpowiednie rozcieńczenia dziesiętne w zależności od rodzaju próbki. Np .: ( ^10-2 , ^10-3 , ^10-4 ). Rozcieńczenia wykonuje się w wodzie peptonowej lub buforze fosforanowym.

Aby to zrobić, należy pobrać 1 ml zawiesiny początkowej i umieścić ją w 9 ml rozpuszczalnika, dalsze rozcieńczenia w razie potrzeby, teraz przy 1 ml 10 ^-2 rozcieńczania i tak dalej.

4) Pobrać 1 ml każdego rozcieńczenia i umieścić na pustych, sterylnych szalkach Petriego.

5) Do każdej płytki dodać 12-15 ml standardowego agaru, uprzednio stopionego i osadzonego w temperaturze 44-47 ° C.

6) Delikatnie obróć płytki, aby równomiernie rozprowadzić próbkę wzdłuż agaru i pozostawić do zestalenia.

7) Odwróć płytki i inkubuj w temperaturze 37 ° C w aerobiozie przez 24 do 48 godzin.

8) Pod koniec czasu płytki są badane i kolonie zliczane w rozcieńczeniu, które na to pozwala. Do zliczenia wybiera się te płytki, które mają od 30 do 300 CFU.

Liczenie można wykonać ręcznie lub przy użyciu sprzętu do liczenia kolonii.

Dopuszczalne wartości na ml próbki mogą się różnić w zależności od kraju, w zależności od przepisów, którym podlegają.

-Calculation UFC

Ogólne obliczenia są wykonywane przy użyciu następującego wzoru:

Wzór do ogólnego obliczenia ilościowego obliczenia CFU. Źródło: Krajowa Administracja Leków, Żywności i Technologii Medycznych (ANMAT). Analiza mikrobiologiczna żywności, oficjalna metodologia analityczna, mikroorganizmy wskaźnikowe. 2014 Tom 3. Dostępny pod adresem: anmat.gov.ar

Wyniki należy wyrazić za pomocą 1 lub 2 cyfr, mnożąc przez odpowiednią podstawę 10. Przykład: jeśli wynik to 16,545, zaokrągla się go na podstawie trzeciej cyfry do 17 000 i będzie wyrażony w następujący sposób: 1,7 x 10 ⁴ . Teraz, jeśli wynik wynosiłby 16436, zaokrąglij go do 16000 i wyrażaj 1,6 x 10 ⁴ .

Technika siewu powierzchniowego

-Proces

-Inocular 0,1 ml bezpośredniego próbki jeśli jest to ciecz, wstępną zawiesinę, 10 ^-1 , lub w kolejnych rozcieńczeniach 10 ^-2 , 10 ^-3 , itp, w centrum standardowej liczby agarowej płytce.

-Równomiernie rozprowadzić próbkę szpatułką Drigalskiego lub szklanym prętem w kształcie litery L. Pozostawić na 10 minut.

-Odwróć płytki i inkubuj w warunkach tlenowych w 37 ° C przez 24 do 48 godzin.

-Przejdź do liczenia kolonii, wybierz te płytki, które są w zakresie od 20 do 250 CFU.

-Calculation UFC

Do obliczeń stosuje się współczynnik rozcieńczenia, który jest odwrotnością. Liczbę zaokrągla się do 2 cyfr znaczących (zaokrąglenie zgodnie z trzecią cyfrą) i wyraża jako potęgę podstawy 10. Na przykład, jeśli w próbce bez rozcieńczenia policzono 224 CFU ( ^10–1 ), odnotowano 22 x 10 ¹ CFU , ale jeśli liczba wynosiła 225, zgłaszane jest 23 x 10 ¹ CFU.

Teraz, gdy 199 CFU są zaliczane do 10 ^-3 rozcieńczania , 20 x 10 ⁴ CFU będzie podano, ale jeśli 153 CFU liczone są w tym samym rozcieńczeniu, 15 x 10 ⁴ CFU zostanie zgłoszony.

QA

Standardowe podłoże hodowlane można ocenić przy użyciu znanych certyfikowanych szczepów, takich jak: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Jeśli pożywka hodowlana jest w optymalnych warunkach, we wszystkich przypadkach oczekuje się zadowalającego wzrostu, z wyjątkiem L. fermentum, która może dawać regularną wydajność.

Aby ocenić jałowość pożywki hodowlanej, jedną lub dwie płytki z każdej przygotowanej partii (bez inokulacji) należy inkubować w temperaturze 37 ° C w warunkach aerobiozy przez 24 godziny. Po tym czasie nie należy obserwować wzrostu ani zmiany koloru pożywki.

Ograniczenia

-Nie rozpuszczaj agaru więcej niż raz.

-Przygotowane podłoże może trwać do 3 miesięcy, o ile jest przechowywane w lodówce i chronione przed światłem.

-To podłoże nie jest odpowiednie dla wymagających lub beztlenowych mikroorganizmów.

Bibliografia

1. Krajowa Administracja Leków, Żywności i Technologii Medycznej (ANMAT). Analiza mikrobiologiczna żywności, oficjalna metodologia analityczna, mikroorganizmy wskaźnikowe. 2014 Tom 3. Dostępny pod adresem: anmat.gov.ar
2. Laboratorios Difco Francisco Soria Melguizo, SA Plate Count Agar. 2009. Dostępne pod adresem: http://f-soria.es
3. Conda Pronadisa Laboratories. Standard Method Agar (PCA) zgodnie z APHA i ISO 4833. Dostępne na: condalab.com
4. Britannia Laboratories. Liczba płytek agarowych. 2015 Dostępne pod adresem: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B i Velázquez O. 2009. Techniques for Microbiological Analysis of Foods. 2nd ed. Wydział Chemii UNAM. Meksyk. Dostępne pod adresem: depa.fquim.unam