AGAR MRS: PODKŁAD, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

MRS agar jest selektywnym stałą pożywkę hodowlaną stosuje się do izolowania i zliczania bakterii kwasu mlekowego, w szczególności z rodzaju Lactobacillus. Agar ten został stworzony w 1960 roku przez Man, Rogosa i Sharpe, nosząc tę ​​samą nazwę, ale ze względu na jego złożoność często używany jest skrót MRS.

Składa się z peptonu proteozy, ekstraktu mięsa, ekstraktu drożdżowego, glukozy, monoleinianu sorbitanu, fosforanu dipotasu, octanu sodu, cytrynianu amonu, siarczanu magnezu, siarczanu manganu i agaru.

Man Rogosa i Sharpe Agar (MRS) wysiane Lactobacillus sp. Źródło: Zdjęcie przekazane do artykułu przez autorów: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Zdjęcie wykonane podczas badania pt .: Ocena bakterii kwasu mlekowego i Bifidobacteria o potencjale probiotycznym w mleku matki i stolcu .

Taki skład pozwala na prawidłowy rozwój bakterii kwasu mlekowego z próbek klinicznych, takich jak kał, wydzielina z pochwy, próbki z jamy ustnej i mleko matki, a także produkty mleczne i mięsne.

Nie jest stosowany rutynowo w laboratoriach klinicznych, ponieważ bakterie kwasu mlekowego rzadko biorą udział w procesach chorobowych. Jednak w obszarze mikrobiologii żywności stosowanie agaru MRS jest częstsze.

Z drugiej strony, pożywka ta jest wykorzystywana przez niektóre Ośrodki Badawcze, których celem jest badanie bakterii kwasu mlekowego.

Podstawa

Agar Man, Rogosa i Sharpe ma dość złożony skład. Rozbijając funkcję każdego z jego składników, można wyjaśnić jego podstawę.

Pepton proteozowy, wyciąg z mięsa, ekstrakt z drożdży i glukoza to składniki odżywcze, które stanowią źródło węgla, azotu, witamin i minerałów niezbędnych do rozwoju bakterii. Ponadto glukoza jest uniwersalnym źródłem energii używanym w większości pożywek hodowlanych.

Z drugiej strony, aby sprzyjać wzrostowi bakterii kwasu mlekowego, konieczna jest obecność kofaktorów (kationów) niezbędnych w metabolizmie Lactobacillus i bakterii pokrewnych; Te związki to sole sodu, magnezu i manganu.

Podobnie monoleinian sorbitanu lub polisorbat 80 są ważnym źródłem kwasów tłuszczowych, ponieważ są wchłaniane jako składniki odżywcze.

Ponadto monoleinian sorbitanu i cytrynian amonu działają hamująco na rozwój flory towarzyszącej, zwłaszcza bakterii Gram-ujemnych, nadając agarowi selektywny charakter.

Wreszcie agar-agar jest tym, który zapewnia stałą konsystencję pożywce.

Istnieją inne warianty agaru Man Rogosa Sharpe; jeden z nich jest uzupełniony cysteiną (MRSc), bardzo przydatną do izolacji między innymi bifidobakterii. Z drugiej strony istnieje pożywka MRS z dodatkiem neomycyny, paromomycyny, kwasu nalidyksowego i chlorku litu, przeznaczona do selektywnego liczenia bifidobakterii w produktach mlecznych.

Przygotowanie

Odważyć 68,25 gramów odwodnionej pożywki i rozpuścić w jednym litrze wody destylowanej. Odstaw na 5 minut. Aby całkowicie się rozpuścić, włącz źródło ciepła, często mieszając, i gotuj przez 1 do 2 minut. Sterylizuj w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut.

Wychodząc z autoklawu, odstawić na kilka minut i rozprowadzić na sterylnych szalkach Petriego na gorąco.

Pozostawić do zestalenia i odwrócić płytki, ułożyć w stojakach na talerze i przechowywać w lodówce do czasu użycia. Przed użyciem pozwól płytkom ogrzać się do temperatury pokojowej.

PH pożywki powinno wynosić 6,4 ± 0,2. Niektóre domy handlowe zalecają pH od 5,5 do 5,9.

Odwodnione podłoże jest koloru beżowego i przygotowane w kolorze ciemnobursztynowym.

Zarówno odwodnione podłoże, jak i przygotowane płytki należy przechowywać w temperaturze 2-8 ° C.

Aplikacje

Płytki agarowe MRS można wysiać powierzchniowo (wyczerpanie lub szpatułka Drigalskiego). Można go również wysiewać na głębokość. Płytki należy inkubować w temperaturze 37 ° C w warunkach mikroaerofilności (4% O ₂ i 5–10% CO ₂ ) przez 24 do 72 godzin.

Sposób siewu dobiera się w zależności od celu (izolacja lub liczenie).

Charakterystyka kolonii

Przypuszczalne kolonie Lactobacillus stają się białawe i mają śluzowaty lub kremowy wygląd na tym agarze. Następnie należy je zidentyfikować.

Izolacja bakterii kwasu mlekowego

W tym celu stosuje się siew powierzchniowy. Próbki do zasiania wymagają wcześniejszej procedury.

W przypadku próbek mleka kobiecego zaleca się odwirowanie 1 ml próbki przy 14 000 obr / min przez 10 minut w celu usunięcia warstwy tłuszczowej. 900 µl odrzuca się, aw pozostałych 100 µl osad zawiesza się i wylewa na powierzchnię agaru MRS i rozprowadza równomiernie szpatułką Drigalskiego.

W przypadku próbek kału, jeden (1) gram kału jest ważony i homogenizowany w 9 ml 0,1% sterylnej wody peptonowej, co odpowiada rozcieńczeniu 1/10. Następnie wykonuje się seryjne rozcieńczenia, aż do uzyskania końcowego rozcieńczenia ^10-4 .

W końcu, 100 ul 10 ^-2 , 10 ^-3 i 10 ^-4 rozcieńczenia i każde rozcieńczenie brane wysiewa się na agarze MRS, równomiernie rozmieszczone z łopatką Drigalskiego.

Liczba bakterii kwasu mlekowego

W tym przypadku siew odbywa się na głębokość.

W przypadku próbek mleka kobiecego pobiera się 1 ml i umieszcza w sterylnej stożkowej plastikowej probówce. Agar MRS dodaje się w przybliżonej temperaturze 40 ° C do końcowej objętości 25 ml, uzyskując jednorodną mieszaninę. Następnie wylewa się go na sterylne szalki Petriego w jednolity sposób i pozostawia do czasu polimeryzacji.

W przypadku próbek kału wykonuje się rozcieńczenia, jak opisano wcześniej. Pobrać 1 ml każdego rozcieńczenia i umieścić w sterylnych stożkowych plastikowych probówkach. Dodaje się stopiony agar MRS do objętości 25 ml.

Mieszaninę każdego rozcieńczenia wlewa się równomiernie na sterylne szalki Petriego. Na koniec odstawia się do czasu polimeryzacji.

Liczbę kolonii na agarze Man Rogosa i Sharpe (MRS). Źródło: zdjęcie przekazane na potrzeby tego artykułu. Autorzy: Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Zdjęcie wykonane podczas badania pt .: Ocena bakterii kwasu mlekowego i Bifidobacteria o potencjale probiotycznym w mleku matki i kale niemowląt.

Poziom badań

Z każdym dniem coraz większym zainteresowaniem cieszą się badania nad bakteriami kwasu mlekowego; Naukowcy szczególnie starają się poznać nowe szczepy i ich potencjał jako starterowy ferment do standaryzacji, między innymi w produkcji produktów mleczarskich.

W tym sensie Alvarado i wsp. (2007) użyli agaru MRS do przeprowadzenia badania, w którym wyizolowali, zidentyfikowali i scharakteryzowali bakterie kwasu mlekowego obecne w rzemieślniczym wenezuelskim andyjskim serze wędzonym.

W serze stwierdzili obecność bakterii z rodzajów Lactococcus i Lactobacillus i doszli do wniosku, że mieszanki izolowanych szczepów nadają się jako szczepy startowe do produkcji serów z mleka pasteryzowanego.

Z drugiej strony Sánchez i wsp. (2017) zastosowali agar MRS do zbadania obecności bakterii kwasu mlekowego w przewodzie pokarmowym prosiąt, aby wykorzystać je jako rodzime probiotyki zwiększające produktywność zdrowych prosiąt.

Za pomocą tego podłoża udało im się wyizolować cztery gatunki: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae i Pediococcus pentosaceus.

Podobnie Báez i in. (2019) zastosowali agar MRS do oceny bakterii kwasu mlekowego (LAB) i bifidobakterii o potencjale probiotycznym w mleku matki i kale niemowląt.

Udało im się wyizolować 11 BAL i 3 Bifidobacteria sp w mleku matki oraz 8 BAL i 2 Bifidobacteria sp. w kale. Wszystkie spełniły określone parametry, które potwierdzają, że są bakteriami o działaniu probiotycznym.

Autorzy doszli do wniosku, że zarówno mleko matki, jak i odchody niemowląt karmionych wyłącznie piersią są naturalnym źródłem bakterii probiotycznych.

QA

Aby ocenić jakość agaru MRS, szczepy kontrolne, takie jak:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli i Bacillus cerei.

Oczekiwane rezultaty to zadowalający wzrost pierwszych 6 bakterii, podczas gdy E. coli i Bacillus cereus muszą być całkowicie zahamowane.

Bibliografia

1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Isolation, Identification and Characterization of Lactic Acid Bacteria from a Venezuelan wędzony andyjski ser rzemieślniczy. Jego użycie jako kultury startowej. Cient. (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. Dostępne pod adresem: scielo.org.
2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro Isolation of Lactic Acid Bacteria from the Digestive Tract of the Piglet. Rev. investiga. weterynarz. Peru 2017; 28 (3): 730–736. Dostępne pod adresem: scielo.org.
3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Ocena bakterii kwasu mlekowego i Bifidobacteria o potencjale probiotycznym w mleku matki i kale niemowląt w gminie Acevedo, Miranda 2017. Praca licencjacka w celu uzyskania tytułu licencjata w Bioanaliza. University of Carabobo, Wenezuela.
4. Britannia Laboratory. Agar MRS. 2015 Dostępne pod adresem: britanialab.com
5. Współtwórcy Wikipedii. Agar MRS. Wikipedia, wolna encyklopedia. 10 stycznia 2018, 19:44 UTC. Dostępne pod adresem: wikipedia.org Dostęp 17 lutego 2019.
6. Roy D. Media do izolacji i zliczania bifidobakterii w produktach mlecznych. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.