AGAR ZIEMNIACZANO-DEKSTROZOWY: UZASADNIENIE, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIE - BIOLOGIA - 2025

Agaru Potato Dextrose Agar jest średnia, stałej i nie - selektywne kultura składnika. Mogą w nim rosnąć gatunki bakterii i grzybów, ale jego zastosowanie jest szczególnie wskazane do izolacji grzybów strzępkowych i drożdżaków. Jest również znany jako podłoże PDA dla angielskiego wyrażenia Potato Dextrose Agar.

Jest szczególnie przydatny do izolacji grzybów fitopatogennych, czyli atakujących rośliny. Aby wysiać próbki z zakażonych warzyw, można zastosować inne środki, takie jak agar Sabourauda lub malta-agar, jednak do rutynowego stosowania preferowany jest agar ziemniaczano-dekstrozowy, ponieważ uzyskuje się większą sporulację.

Aspergillus niger i Sinemas odpowiednio na agarze ziemniaczano-dekstrozowym. Źródło: Alextrevelian 006 z angielskiej Wikipedii / Joselrojas

Służy również do liczenia kolonii grzybów w próbkach kosmetyków, produktów farmaceutycznych i niektórych produktów mlecznych. Nadaje się również do wysiewu próbek skrawków skóry w poszukiwaniu dermatofitów, które bardzo dobrze rosną w tym podłożu, rozwijając swoje charakterystyczne pigmenty.

Podłoże z glukozą ziemniaczaną jest bardzo prostym i łatwym do przygotowania w laboratorium podłożem. Zawiera, jak sama nazwa wskazuje, napar z ziemniaków, dekstrozę i agar-agar. Dodatkowo można dodać substancje hamujące, aby zapobiec rozwojowi bakterii i zwiększyć selektywność względem gatunków grzybów.

Podstawa

Agar ziemniaczano-glukozowy to pożywka, która dostarcza składników odżywczych niezbędnych do rozwoju grzybów strzępkowych i drożdży.

Połączenie naparu ziemniaczanego z glukozą stanowi doskonałe źródło energii dla zadowalającego wzrostu grzybów. Podczas gdy agar jest tym, który zapewnia konsystencję pożywce.

Pożywka sama w sobie nie hamuje wzrostu bakterii, dlatego jest to podłoże nieselektywne. Aby był selektywny, potrzebuje dodatku substancji hamujących, takich jak kwas winowy czy antybiotyki.

Przygotowanie

-Domowe (niekomercyjne) przygotowanie agaru ziemniaczano-dekstrozowego

Szalki Petriego

Jest przygotowany w następujący sposób:

W pierwszej kolejności ziemniaki są bardzo dobrze myte, usuwając posiadaną ziemię. Są krojone w cienkie plasterki ze wszystkim i skorupą. Waży się 200 gramów ziemniaków i gotuje w litrze wody destylowanej przez pół godziny.

Na koniec przefiltruj lub przecedzić cały preparat przez gazę.

Otrzymaną ciecz uzupełnia się wodą destylowaną do 1 litra. Do infuzji dodaje się 20 g agaru-agaru i 20 g dekstrozy, dobrze miesza i autoklawuje w 121 ° C, pod ciśnieniem 15 funtów przez 15 minut.

Pozostawić do ostygnięcia do 50 ° C i podawać na sterylnych szalkach Petriego. Przygotowane talerze są przechowywane w lodówce.

Kliny

Można również przygotować kliny z agarem ziemniaczano-dekstrozowym.

W tym przypadku przed sterylizacją w autoklawie 12 do 15 ml pożywki umieszcza się w probówkach, następnie sterylizuje w autoklawie i po odstawieniu układa się na specjalnych podporach aż do zestalenia. Przechowywać w lodówce.

Pożywka ma pH 5,6 ± 0,2, jednak niektóre laboratoria dodają 10% kwas winowy w celu obniżenia pH do 3,1 ± 0,1 w celu zahamowania wzrostu bakterii.

W tym samym sensie inne laboratoria wolą dodawać antybiotyki, aby były selektywne w hodowli grzybów i zapobiegały rozwojowi bakterii.

- Handlowe przygotowanie agaru ziemniaczanego z dekstrozą

Odważyć 39 g dostępnego w handlu odwodnionego podłoża i rozpuścić w jednym litrze wody destylowanej. Odstaw na 5 minut.

Mieszaninę ogrzewa się, często mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia. Następnie jest sterylizowany w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut.

Można przygotować talerze lub kliny. Postępuj jak opisano powyżej.

PH pozostaje na poziomie 5,6 ± 0,2. Jeśli pożądane jest pH 3,1, przed podaniem na płytki należy dodać 14 ml sterylnego 20% kwasu winowego.

Surowe podłoże jest beżowe, a przygotowane podłoże jest jasno bursztynowe o lekko mętnym lub opalizującym wyglądzie.

Aplikacje

Proces wysiewu próbek roślin na agarze z glukozą ziemniaczaną

-Dla poplamionych liści

Liście są pocięte na kawałki.

W szklance o pojemności 50 cm3 z 50% alkoholem umieść kawałki liści (poplamione i zdrowe kawałki), aby zdezynfekować powierzchnię przez 20 do 30 sekund. Wyrzuć alkohol i dodaj 20% podchlorynu sodu na 40 do 50 sekund, jeśli są to cienkie liście, i wydłuż czas do 80 sekund, jeśli jest to kora i kłody.

Wyrzucić podchloryn sodu, zdezynfekowane części wyjąć sterylną szczypcami i umieścić na powierzchni podłoża (maksymalnie 10 sztuk). Ustaw datę i inkubuj w temperaturze 20-30 ° C.

-Do owoców i bulw

Jeśli owoc jest mięsisty, otwórz owoc zaatakowany przez grzyba i wyjmij sterylnym skalpelem kawałki zarówno z chorych, jak i zdrowych części i umieść je na powierzchni agaru.

Jeśli owoc jest cytrusowy, taki jak cytryna lub pomarańcza, należy go otworzyć i wysiać nasiona.

W przypadku zaatakowania powierzchni owocu i zaobserwowania zarodników idealnym rozwiązaniem jest zastosowanie metody tarcia na talerzu; Polega ona na dotknięciu zarodników wysterylizowaną i schłodzoną szpatułką w kształcie litery „L”, a następnie zrobieniu zygzaka wysiewu 2 do 3 razy na agarze.

-Do zbóż

Są dezynfekowane zgodnie z opisem na liściach, a następnie umieszczane na agarze.

-Do gałęzi i łodyg

Kora jest zdrapywana, a później kawałki zdrowej i chorej części są pobierane i wysiewane bezpośrednio na agar.

Wysiane płytki inkubuje się w warunkach tlenowych w 20-30 ° C przez 72 godziny.

Proces wysiewu próbek skóry, włosów lub łusek paznokciowych na agarze z glukozą ziemniaczaną

Pobieranie próbek powinno odbywać się za pomocą ostrza skalpela nr 11 w celu obcięcia dotkniętych włosów, łusek skóry lub paznokci w poszukiwaniu dermatofitów. Przed pobraniem próbki obszar należy zdezynfekować 70% alkoholem.

-Próbka skóry

W przypadku łuszczących się zmian należy zeskrobać krawędź zmiany, ponieważ istnieje większe prawdopodobieństwo, że tam znajdzie się grzyb.

W przypadku zmian wysiękowych próbkę pobiera się suchym lub mokrym wacikiem. Natychmiast wysiać na agarze z glukozą ziemniaczaną lub agarem Sabouraud. Unikaj środków transportu.

Inną metodą pobierania próbek jest technika dywanowa Mariat i Adan Campos. W takim przypadku dotknięty obszar pociera się 5 razy kawałkiem sterylnej wełny do późniejszej uprawy.

Próbkę można umieścić bezpośrednio w pożywce hodowlanej.

Próbka włosów

W zależności od patologii dotkniętą część można odciąć lub wyrwać z korzeniami. Umieść próbkę w pożywce.

-Próbka paznokci

Określoną część dotkniętego paznokcia można zdrapać lub wyciąć. Zależy to od rodzaju kontuzji.

Przed wysianiem pokrój próbkę na 1 mm kawałki, aby zwiększyć prawdopodobieństwo kontaktu grzyba z pożywką.

Procedura identyfikacji

Kolonie uzyskane na płytce izoluje się w probówkach zawierających agar z glukozą ziemniaczaną, aby następnie przeprowadzić makroskopowe badanie kolonii (wygląd, kolor, konsystencja, stopień rozwoju.

Badanie mikroskopowe (obserwacja struktur i ich formacji) może być przeprowadzone za pomocą mikrokultur lub bezpośredniej obserwacji pod mikroskopem pomiędzy szkiełkiem a szkiełkiem.

Liczba kolonii

Pożywkę tę można również stosować do określania obciążenia grzybami i drożdżami obecnymi w próbkach roślin, żywności, kosmetyków lub leków. W tym celu stosuje się agar ziemniaczano-dekstrozowy z dodatkiem antybiotyków, takich jak: (chloramfenikol, chlorotetracyklina lub oba).

Wlej 1 ml próbki - najlepiej rozcieńczonej - do sterylnej i pustej szalki Petriego, a następnie rozpuść płatek agaru ziemniaczano-dekstrozowego i pozostaw do ostygnięcia do 45 ° C. Wlać na szalkę Petriego i obracać do homogenizacji. Odczekaj, aż się zestali.

Inkubuj w warunkach tlenowych w temperaturze 20–25 ° C (pleśnie) lub 30–32 ° C (drożdże) przez 5–7 dni lub dłużej, w zależności od rodzaju poszukiwanego grzyba i rodzaju próbki. Do inkubacji w obu zakresach temperatur można użyć dwóch płytek.

Liczenie kolonii grzybów w próbce żywności. Agar ziemniaczano-dekstrozowy z dodatkiem antybiotyków. Źródło: zdjęcie Pxhere.com / 777267

Utrzymanie szczepów grzybów

Agar ziemniaczano-dekstrozowy może być stosowany do utrzymania żywotnych szczepów grzybów przez kilka lat.

W tym celu grzyb hoduje się na kawałkach agaru z glukozą ziemniaczaną, a gdy już rośnie, jest on pokrywany olejem mineralnym. Olej powinien być sterylizowany w autoklawie przez 45 minut i mieć lepkość około 300 do 330 Saybolt. Olej powinien znajdować się 1 do 2 cm powyżej końcówki skosu.

QA

Z każdej przygotowanej partii pobrać 1 lub 2 płytki i inkubować je w 25 ° C przez 48 godzin lub w 20 ° C przez 96 godzin. Dobra kontrola bezpłodności to taka, w której nie obserwuje się rozwoju kolonii.

Można również stosować znane lub certyfikowane szczepy kontrolne, takie jak:

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus brasiliensis ATCC 16404, Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533. Oczekuje się dobrego wzrostu we wszystkich przypadkach.

Bibliografia

1. Britannia Laboratories. Ziemniak z agarem glukozowym. 2015 Dostępne pod adresem: britanialab.com
2. Neogen Laboratories. Agar ziemniaczano-dekstrozowy. Dostępne pod adresem: foodsafety.neogen.com
3. Laboratorium Insumolab. Agar ziemniaczano-dekstrozowy. Dostępne pod adresem: insumolab.cl
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
5. Casas-Rincón G. General Mycology. 1994. Wydanie drugie Central University of Venezuela, Library Editions. Wenezuela Caracas.
6. Aceituno M. Ocena jakości mikrobiologicznej cienia do powiek w postaci proszku kompaktowego Krajowego Laboratorium Produkcyjnego według Metody Referencyjnej Pharmacopea Usp 2005. Praca dyplomowa kwalifikująca do tytułu chemika farmaceutycznego. Uniwersytet San Carlos w Gwatemali.
7. Cuétara M. Przetwarzanie próbek powierzchni. Iberoamerican Journal of Mycology. 2007; s. 1-12