AGAR SABOURAUDA: PODKŁAD, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Agar Sabourauda , znany również jako Sabouraud Dextrose Agar, jest stałe podłoże, w szczególności wzbogacony w celu izolacji i rozwój grzybów, takich jak drożdże, pleśnie i Dermatophytes.

Dlatego nie może zabraknąć tego pożywki w laboratorium mikrobiologicznym do badania obecności patogennych lub oportunistycznych grzybów, zarówno z próbek klinicznych, jak i nieklinicznych. Podobnie jest również idealny do wzrostu bakterii nitkowatych, takich jak Streptomyces i Nocardias. Jego zastosowanie jest bardzo szerokie, ponieważ może być stosowany w mikologii ludzi, zwierząt, roślin i przemysłowych.

A. Agar Sabourauda bez nasion. B. Agar Sabourauda wysiany drożdżami. Źródło: Zdjęcia autorstwa mgr inż. Marielsa gil

Pożywka ta została stworzona w 1896 roku przez wybitnego dermatologa Raimonda Sabourauda, ​​który stał się światowej sławy specjalistą w chorobach skóry głowy, głównie wywoływanych przez dermatofity.

Jego stworzenie było tak ważne, że od tamtej pory jest używany i pozostaje do dziś, choć z pewnymi modyfikacjami.

Chociaż jest to szczególne dla grzybów, bakterie mogą rosnąć w tym podłożu, dlatego w przypadku próbek z mieszaną florą konieczne jest włączenie antybiotyków do ich preparatu, aby zahamować wzrost flory bakteryjnej, która może być obecna.

Wyboru antybiotyku należy dokonać ostrożnie i wziąć pod uwagę rodzaj grzyba, który ma zostać odzyskany, ponieważ niektóre substancje są hamowane przez obecność pewnych substancji.

Podstawa

Agar Sabouraud z dekstrozą jest pożywką, która w swoim pierwotnym składzie jest słabo selektywna, ze względu na kwaśne pH wynoszące 5,6 ± 0,2, jednak bakterie mogą nadal się rozwijać, głównie podczas długotrwałych inkubacji.

Pożywka zawiera pepton kazeinowy i trzustkowy hydrolizat tkanki zwierzęcej, które są źródłem węgla i azotu dla wzrostu mikroorganizmów.

Zawiera również wysokie stężenie glukozy, która działa jako źródło energii, sprzyjając rozwojowi grzybów nad bakteriami. Wszystko to zmieszane z agarem-agarem, składnikiem nadającym mu odpowiednią konsystencję.

Z drugiej strony agar Sabouraud z dekstrozą może być selektywny, jeśli doda się antybiotyki.

W przypadku antybiotyków jest szczególnie przydatny w próbkach ran, otwartych wrzodów lub wszelkich próbkach, w których istnieje podejrzenie dużego skażenia bakteryjnego.

Najczęściej używane kombinacje agaru Sabouraud z dekstrozą i antybiotykami

-Agar Saburaud z chloramfenikolem: idealny do regeneracji drożdży i grzybów strzępkowych.

- Agar Sabourauda z gentamycyną i chloramfenikolem: prawie wszystkie grzyby strzępkowe i drożdże rosną w tym podłożu i hamują dużą liczbę bakterii, w tym Enterobacteriaceae, Pseudomonas i Staphylococcus.

- Agar Sabourauda z cykloheksymidem: jest szczególnie przydatny do próbek ze skóry lub dróg oddechowych, o ile podejrzewane są grzyby dimorficzne.

Należy zachować ostrożność podczas stosowania cykloheksymidu; Chociaż jest stosowany do hamowania wzrostu niepatogennych lub środowiskowych grzybów i drożdży, które mogą być obecne jako zanieczyszczenia w próbce, hamuje również wzrost niektórych grzybów, takich jak Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Allescheria boydii, Penicillium sp i inne grzyby oportunistyczne.

- Agar Sabourauda z chloramfenikolem i cykloheksymidem: służy głównie do izolacji dermatofitów i grzybów dimorficznych. Ma tę wadę, że hamuje działanie niektórych gatunków grzybów oportunistycznych, takich jak Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes czy C. neoformans.

- Agar Sabourauda z chloramfenikolem, streptomycyną, penicyliną G i cykloheksymidem: idealnie nadaje się do próbek skrajnie zanieczyszczonych bakteriami i grzybami saprofitycznymi, ale ma tę wadę, że hamuje wzrost promieniowców i nocardii, oprócz wspomnianych wyżej grzybów oportunistycznych.

Przygotowanie

Jeśli masz składniki osobno, możesz je przygotować w następujący sposób:

Agar Sabouraud z dekstrozą

Ważyć:

- 40 gr dekstrozy

- 10 g peptonu

- 15 g agaru-agaru

- Odmierz 1000 ml wody destylowanej

Wszystkie składniki miesza się, pH ustawia się na 5,6. Substancje rozpuszczone rozpuszcza się przez gotowanie, 20 ml pożywki rozprowadza się w probówkach o wymiarach 25 x 150 mm, bez krawędzi i najlepiej z bawełnianą nasadką.

Rurki z bawełnianą nasadką. Źródło: Zdjęcie autorstwa mgr inż. Marielsa gil

W zależności od dostępności można również zastosować inne rozmiary rur.

Są autoklawowane przez 10 minut w atmosferze ciśnienia (121 ° C). Nie należy przekraczać czasu autoklawowania. Wychodząc z autoklawu, probówki są pochylane za pomocą wspornika, aż zestalą się w dziobie fletu.

Innym sposobem jest rozpuszczenie składników przez ogrzewanie, aż się zagotują. Autoklawuj przez 10 minut w tej samej fiolce, a następnie rozprowadź 20 ml na szalkach Petriego.

Jeśli masz podłoże agarowe Sabouraud z dekstrozą, które zawiera już wszystkie składniki, zważ ilość określoną przez firmę handlową na jeden litr wody. Pozostałe kroki są takie same, jak te opisane powyżej.

Agar Sabouraud z dekstrozą (modyfikacja Emmonsa)

Ważyć:

- 20 gr dekstrozy

- 10 g peptonu

- 17 gr agaru-agaru

- Odmierz 1000 ml wody destylowanej

Wszystkie składniki miesza się, pH ustawia się na 6,9. Postępuj analogicznie jak w poprzednim przypadku.

Są domy handlowe, które oferują to medium ze wszystkimi składnikami. W takim przypadku zważ i przygotuj zgodnie z opisem na wkładce.

Agar Sabouraud z dekstrozą (modyfikacja Emmonsa) z chloramfenikolem

Roztwór podstawowy chloramfenikolu

- Odważyć 500 mg zasady chloramfenikolu

- Odmierz 100 ml 95% etanolu

- Wymieszaj

Agar Sabouraud z dekstrozą (Emmons) przygotowuje się zgodnie z wcześniejszym opisem i dodatkowo na każdy litr pożywki dodać 10 ml roztworu podstawowego chloramfenikolu przed autoklawowaniem.

Agar dekstrozowy Sabourauda Emmonsa z cykloheksymidem

Roztwór podstawowy cykloheksymidu

- Odważyć 5 gr cykloheksymidu

- Odmierz 100 ml acetonu

- Wymieszaj

Podłoże agarowe Sabouraud z dekstrozą (Emmons) przygotowuje się zgodnie z opisem i dodatkowo na każdy litr podłoża dodać 10 ml roztworu podstawowego cykloheksymidu przed autoklawowaniem.

Agar Sabouraud z dekstrozą (Emmons) z chloramfenikolem i cykloheksymidem

Podłoże agarowe Sabouraud z dekstrozą (Emmons) przygotowuje się zgodnie z wcześniejszym opisem i dodatkowo na każdy litr podłoża dodać 10 ml roztworu podstawowego chloramfenikolu i 10 ml roztworu podstawowego cykloheksymidu przed autoklawowaniem.

Inne antybiotyki, które można dodać

20 000 do 60 000 jednostek penicyliny na litr podłoża.

30 mg streptomycyny na litr podłoża.

Obydwa muszą zostać wprowadzone po sterylizacji w autoklawie, lekko schłodzonej (50-55 ° C).

0,04 g neomycyny na litr podłoża.

0,04 g gentamycyny na litr podłoża.

Uwagi specjalne

Ze względów bezpieczeństwa lepiej jest wysiewać agar Sabouraud z dekstrozą w probówkach w kształcie klina (nachylonych dziobem w kształcie rowka) niż na szalkach Petriego, aby uniknąć rozpraszania i wdychania zarodników.

Ważne jest, aby probówki z agarem Sabourauda były przykryte bawełną, a nie zakrętką, ponieważ wykazano, że warunki półbeztlenowe hamują tworzenie się zarodników u niektórych szczepów, na przykład Coccidioides immitis. Ponadto większość grzybów jest aerobowa.

W przypadku stosowania zakrętki nie zamykaj hermetycznie.

QA

Przygotowane pożywki muszą przejść kontrolę jakości w celu zweryfikowania ich prawidłowego działania. W tym celu wysiewa się pewne szczepy kontrolne.

W przypadku agaru Sabouraud z dekstrozą i chloramfenikolem można zastosować szczepy ATCC Candida albicans, które muszą mieć doskonały wzrost. Na kolejnej płytce szczepiono szczepami Escherichia coli, które należy całkowicie zahamować.

Inkubuje się również niezaszczepioną płytkę, na której nie powinny rosnąć żadne mikroorganizmy.

Do agaru Sabouraud z dekstrozą z chloramfenikolem i cykloheksymidem można użyć szczepów Trichophyton mentagrophytes, które powinny się dobrze rozwinąć. Kolejną płytkę zaszczepia się szczepem Aspergillus flavus, na którym wzrost musi być niewielki lub żaden. Dodatkowo niezaszczepiona płytka jest inkubowana w celu wykazania jej sterylności.

Do agaru Sabouraud z dekstrozą z cykloheksymidem stosuje się szczepy Candida albicans, Trichophyton rubrum lub Microsporum canis, które muszą wykazywać dobry wzrost.

Obejmuje również szczep Aspergillus flavus wykazujący niewielki wzrost lub jego brak. Na koniec inkubuj niezaszczepioną płytkę, aby kontrolować sterylność.

Aplikacje

Kultura pierwotna

Klasyczny agar dekstrozowy Sabouraud zawiera 4 gramy dekstrozy i jest doskonały jako podstawowe podłoże izolacyjne, ponieważ wykazuje charakterystyczną morfologię każdego grzyba.

Doskonale nadaje się również do demonstrowania produkcji pigmentów. Jednak nie jest to najlepszy sposób obserwacji sporulacji.

Nie jest również zalecany do hodowli Blastomyces dermatitidis, który jest hamowany przez wysokie stężenie obecnej glukozy.

Z drugiej strony w przypadku uprawy należy wziąć pod uwagę pewne kwestie.

Niektóre grzyby rosną najlepiej w temperaturze pokojowej, na przykład pleśnie, inne z powodzeniem rosną w 37 ° C, na przykład niektóre drożdże, a inne mogą rosnąć w obu temperaturach (grzyby dimorficzne).

Z tego powodu czasami konieczne jest użycie kilku płytek agarowych Sabourauda do tej samej próbki, ponieważ często wykonuje się podwójne posiewanie w celu inkubacji jednej płytki w temperaturze pokojowej, a drugiej w 37 ° C.

Na przykład Sporothrix schenckii wysiewa się na dwóch talerzach; jeden inkubuje się w temperaturze pokojowej w celu uzyskania fazy pleśni, a drugi w 37 ° C w celu uzyskania fazy drożdżowej, przy czym w tej ostatniej konieczne jest dodanie 5% krwi do pożywki.

W innych przypadkach, takich jak próbki mycetoma, wysiewa się dwie płytki agarowe Sabourauda, ​​jedną chloramfenikolem, a drugą cykloheksymidem. Pierwsza z nich pozwoli na rozwój czynników wywołujących grzybicę pochodzenia grzybiczego (Eumycetoma), a druga czynników wywołujących grzybniaki pochodzenia bakteryjnego, takich jak promieniowce.

Sporulacja

Emmons Modified Sabouraud Dextrose Agar zawiera 2 gramy dekstrozy i jest używany nie tylko do izolacji, ale także do sporulacji i konserwacji grzybów.

W tej pożywce można odzyskać szczepy Blastomyces dermatitidis.

Ochrona

Aby zachować kultury grzybów, można je przechowywać w lodówce (2-8 ° C). Czas konserwacji może wynosić od 2 do 8 tygodni. Po tym czasie należy je poddać podhodowli, aby powtórzyć proces.

Niektóre grzyby najlepiej przechowywać w temperaturze pokojowej, na przykład Epidermophyton foccosum, Trichophyton schoenleinnii, T. violaceum i Microsporum audounii.

Utrzymanie szczepu można wydłużyć, aby uniknąć pleomorfizmu, jeśli dekstroza zostanie całkowicie usunięta z agaru i jeśli ilość agaru w pożywce zostanie zmniejszona, aby uniknąć wysuszenia.

Mikrokultury

W celu identyfikacji niektórych grzybów strzępkowych konieczne jest wykonanie mikrokultur z użyciem agaru Sabourauda lub innych specjalnych środków do obserwacji struktur rozmnażania płciowego i bezpłciowego.

W mikologii człowieka

Służy głównie do diagnostyki chorób grzybiczych, zwłaszcza tych, które dotyczą skóry i jej przyczepów (włosów i paznokci).

Próbkami mogą być wydzieliny, wysięki, skóra, włosy, paznokcie, plwocina, płyn mózgowo-rdzeniowy lub mocz. Powszechnie izolowanymi patogenami są dermatofity, grzyby wywołujące grzybice podskórne i układowe.

Mikologia zwierząt

Zwierzęta często są dotknięte infekcjami grzybiczymi, dlatego agar Sabourauda jest równie przydatny w mikologii zwierząt, jak u ludzi.

Na przykład dermatofity mogą często atakować zwierzęta. Tak jest w przypadku Microsporum canis var distortum, który często infekuje psy, koty, konie, świnie i małpy. Podobnie Microsporum gypseum zaraża psy, koty i zwierzęta gospodarskie.

Microsporum gallinae ma wpływ na ptaki, takie jak kury, koguty i kury.

Inne grzyby, takie jak Zymonema farciminosum, są również przyczyną chorób u zwierząt, głównie u koni, mułów i osłów, wywołując znaczne zapalenie naczyń limfatycznych.

Sporothrix schenkii i Histoplasma capsulatum atakują zwierzęta domowe i ludzi.

Mikologia środowiska

Wiele patogennych lub oportunistycznych grzybów może koncentrować się w dowolnym momencie w danym środowisku, szczególnie na salach operacyjnych i oddziałach intensywnej terapii (OIT) klinik i szpitali. Dlatego konieczne jest ich kontrolowanie.

Inne wrażliwe miejsca to biblioteki i stare budynki, na które może mieć wpływ koncentracja grzybów środowiskowych.

W badaniach środowiskowych do izolacji grzybów stosuje się agar Sabouraud z dekstrozą.

Mikologia przemysłowa

Agar dekstrozowy Sabourauda nie może być nieobecny do badania grzybów skażających przy produkcji m.in. kosmetyków, żywności, napojów, skór, tekstyliów.

Mikologia roślin

Rośliny cierpią również na choroby wywoływane przez grzyby, dotykające różne części rośliny, które mogą nawet zakończyć zbiory, powodując ogromne straty w rolnictwie.

Bibliografia

1. Cuenca M, Gadea I, Martín E, Pemán J, Pontón J, Rodríguez (2006). Diagnostyka mikrobiologiczna grzybic i badania wrażliwości na leki przeciwgrzybicze. Zalecenia Hiszpańskiego Towarzystwa Chorób Zakaźnych i Mikrobiologii Klinicznej. Dostępne pod adresem: coesant-seimc.org
2. Laboratorium ValteK. (2009). Agar Sabouraud z dekstrozą i cykloheksymidem. Dostępne pod adresem: andinamedica.com.
3. Navarro O. (2013). Mikologia weterynaryjna. Narodowy Uniwersytet Rolniczy. Nikaragua.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott Microbiological Diagnosis. 12 ed. Argentyna. Od redakcji Panamericana SA
5. Casas-Rincón G. General Mycology. 1994. Wydanie drugie Central University of Venezuela, Library Editions. Wenezuela Caracas.