AGAR Z KRWIĄ: UZASADNIENIE, ZASTOSOWANIA I PRZYGOTOWANIE - BIOLOGIA - 2026

Agar krwi jest stałą pożywkę hodowlaną wzbogaconą różnica ale nieselektywne. Służy do odzyskiwania i wzrostu wielu różnych mikroorganizmów z próbek klinicznych lub do hodowli subkultur.

Do wysiewu większości próbek klinicznych otrzymanych w laboratorium należy dołączyć klasyczny agar z krwią; z wyjątkiem próbek kału, w przypadku których nie jest to przydatne, chyba że zostały przygotowane z pewnymi modyfikacjami.

Płytka agarowa z krwią

Ta pożywka hodowlana składa się zasadniczo ze wzbogaconego podstawowego agaru i 5% krwi. Podłoże agaru może się różnić w zależności od potrzeb, ale będzie się składać głównie z peptonów, aminokwasów, witamin, ekstraktu mięsnego, chlorku sodu, agaru.

Jeśli chodzi o krew, zwykle wymagany jest kontakt z wiwarium, aby uzyskać krew od zwierząt, takich jak owca, królik lub koń. Jednak nie zawsze jest to możliwe i czasami używa się ludzkiej krwi.

Podłoże agarowe z krwią można przygotować w laboratorium lub zakupić gotowe w dedykowanych firmach. Przygotowanie tego podłoża należy do najdelikatniejszych, wszelkie niedbałe przygotowanie spowoduje skażenie wsadu.

Dlatego należy przedsięwziąć wszelkie możliwe środki ostrożności, a na koniec przeprowadzić kontrolę jakości poprzez inkubację w temperaturze 37 ° C 1 płytkę na 100 przygotowanych płytek.

Podstawa

Staphylococcus aureus hodowany na agarze z krwią. Nathan Reading na Flickr Nathan R. na Twitterze, za pośrednictwem Wikimedia Commons Wspomniano już, że agar z krwią charakteryzuje się tym, że jest wzbogaconym, różnicującym i nieselektywnym podłożem. Podstawy każdej z tych właściwości wyjaśniono poniżej.

Agar z krwią jest wzbogaconym podłożem, ponieważ zawiera 5–10% krwi na podłożu agarowym jako głównym dodatkiem. Oba związki zawierają wiele składników odżywczych, a ta właściwość pozwala na rozwój większości hodowlanych bakterii.

Ten wzrost zachodzi bez ograniczeń; z tego powodu jest nieselektywny. Jeśli jednak do tego podłoża zostaną dodane związki, które zapobiegają rozwojowi niektórych mikroorganizmów, a sprzyjają innym, staje się ono selektywne. Dzieje się tak w przypadku dodania określonych rodzajów antybiotyków lub leków przeciwgrzybiczych.

Podobnie, agar z krwią jest podłożem różnicującym, ponieważ pozwala nam rozróżnić 3 typy bakterii: beta-hemolityczne, alfa-hemolityczne i gamma-hemolityczne.

Beta-hemolityki to te, które mają zdolność całkowitej lizy lub rozkładu krwinek czerwonych, tworząc wyraźną aureolę wokół kolonii, dlatego wytwarzają ß lub ß -hemolizę, a mikroorganizmy nazywane są ß-hemolitycznymi.

Przykładami bakterii ß-hemolitycznych są Streptococcus pyogenes i Streptococcus agalactiae.

Alfa-hemolityki to te, które przeprowadzają częściową hemolizę, podczas której hemoglobina utlenia się do methemoglobiny, powodując zielonkawe zabarwienie wokół kolonii. Zjawisko to znane jest jako α lub α -hemoliza, a bakterie są klasyfikowane jako α - hemolityczne.

Przykładami bakterii α-hemolitycznych są Streptococcus pneumoniae i Streptococcus z grupy viridans.

Wreszcie istnieją tak zwane bakterie gamma-hemolityczne lub niehemolityczne. Rosną one na agarze bez powodowania na nim zmian, co jest efektem nazywanym γ -hemolizą, a mikroorganizmy są γ -hemolityczne.

Przykład bakterii hemolitycznej γ: niektóre szczepy Streptococcus grupy D (Streptococcus bovis i Enterococcus faecalis).

Aplikacje

Podłoże do hodowli z agarem z krwią jest jednym z najczęściej stosowanych w laboratorium mikrobiologicznym.

Wśród mikroorganizmów zdolnych do wzrostu w podłożu agarowym z krwią są: bakterie ścisłe tlenowe, fakultatywne, mikroaerofilne, beztlenowe, Gram dodatnie lub Gram ujemne, bakterie szybko lub wolno rosnące.

Rosną również niektóre bakterie wymagające pożywienia lub wybredne, a także grzyby i drożdże. Podobnie jest przydatna do hodowli następczej lub reaktywacji szczepów, które są metabolicznie bardzo słabe.

Jednak wybór grupy krwi i podłoża agarowego będzie różny w zależności od prawdopodobnego drobnoustroju podejrzanego o wyzdrowienie i zastosowania, w jakim płytka ma być używana (posiew lub antybiogram).

Wybór grupy krwi

Krew może być jagnięcą, królikiem, końską lub ludzką.

Najbardziej polecana jest krew jagnięca, z pewnymi wyjątkami. Na przykład, aby wyizolować gatunki Haemophilus, w przypadku których zalecaną krwią jest krew końska lub królika, ponieważ krew jagnięca zawiera enzymy hamujące czynnik V.

Najmniej polecany jest człowiek, jednak najczęściej jest używany, być może dlatego, że jest najłatwiejszy do zdobycia.

Krew musi być odwłókniona, uzyskana bez jakiegokolwiek dodatku i od zdrowych zwierząt. Przy stosowaniu ludzkiej krwi należy wziąć pod uwagę kilka czynników:

Jeśli krew pochodzi od osób, które przeszły infekcje bakteryjne, będą miały one specyficzne przeciwciała. W takich warunkach wzrost niektórych bakterii może zostać zahamowany.

Jeśli pochodzi z banku krwi, zawiera cytrynian i niektóre bakterie mogą nie rosnąć w jego obecności. Z drugiej strony, jeśli krew pochodzi od pacjentów przyjmujących antybiotyki, można zahamować rozwój wrażliwych bakterii.

A jeśli krew pochodzi od osoby z cukrzycą, nadmiar glukozy zaburza prawidłowy rozwój wzorców hemolizy.

Wybór typu podstawowego agaru

Podstawowy agar użyty do przygotowania agaru z krwią może być bardzo szeroki. Wśród nich są: agar odżywczy, agar infuzyjny mózg-serce, agar tryptykazowo-sojowy, agar Müeller Hinton, agar Thayer Martin, agar Columbia, agar Brucella, agar Campylobacter itp.

Zastosowania agaru z krwią w zależności od podłoża podstawowego użytego do jego przygotowania

Agar odżywczy

Baza ta jest najmniej wykorzystywana, ponieważ będzie hodować głównie mało wymagające bakterie, takie jak m.in. pałeczki jelitowe, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp. Nie zaleca się izolowania Streptococcus.

Agar z infuzją mózgu i serca (BHI)

Jest jednym z najczęściej stosowanych jako baza pod agar z krwią, ponieważ zawiera składniki odżywcze niezbędne do wzrostu większości bakterii, w tym Streptococcus sp i innych wymagających bakterii. Chociaż obserwowanie wzorców hemolizy nie jest właściwe.

Do tej bazy zwykle używana jest krew jagnięca.

Można również przygotować warianty agaru z krwią, w którym dodaje się inne związki w celu izolacji niektórych mikroorganizmów. Na przykład agar Brain Heart Infusion z dodatkiem krwi królika, cystyny ​​i glukozy może być użyty do izolacji Francisella tularensis.

Natomiast w przypadku tellurynu cystyny ​​jest on przydatny do izolacji Corynebacterium diphteriae. Można użyć krwi ludzkiej lub jagnięcej.

Przy pierwszej beta-hemolizie będzie widoczne jako wąskie halo, podczas gdy przy drugim halo będzie znacznie szersze.

Podobnie, ta baza, razem z bacytracyną, skrobią kukurydzianą, krwią końską i innymi dodatkami wzbogacającymi (IsoVitaleX), jest używana do izolacji rodzaju Haemophilus sp. Z próbek układu oddechowego.

Również jeśli doda się połączenie antybiotyków chloramfenikol - gentamycyny lub penicyliny - streptomycyny z końską krwią, idealnie nadaje się do izolacji wymagających patogennych grzybów, nawet z wyższym plonem niż agar glukozowy Sabourauda. Jest szczególnie przydatny w izolacji Histoplasma capsulatum.

Agar sojowy Trypticase

Podstawa ta jest najbardziej zalecana dla lepszej obserwacji wzoru hemolizy oraz do wykonywania testów diagnostycznych, takich jak taksony optokiny i bacytracyna. Jest to klasyczny agar z krwią, który jest używany rutynowo.

Na tej bazie można również przygotować specjalny agar z krwią dla Corynebacterium diphteriae, z tellurem cystyny ​​i krwią jagnięcą .

Podobnie, połączenie tego agaru z krwią jagnięcą i kanamycyną-wankomycyną jest idealne do wzrostu beztlenowców, zwłaszcza Bacteroides sp.

Agar Müellera Hintona

Baza ta uzupełniona krwią służy do przeprowadzania antybiogramów drobnoustrojów wybrednych, takich jak Streptococcus sp.

Jest również przydatny do izolacji bakterii, takich jak Legionella pneumophila.

Thayer Martin Agar

Podłoże to jest idealne jako podłoże dla agaru z krwią, gdy podejrzewa się rodzaj Neisseria, zwłaszcza Neisseria meningitidis, ponieważ N. gonorrhoeae nie rośnie na agarze z krwią.

Służy również do badania wrażliwości na Neisseria meningitidis.

Agar Columbia

Ta baza jest doskonała do wysiewu próbek biopsji żołądka w kierunku Helicobacter pylori.

Pożywkę przygotowuje się przez dodanie 7% krwi jagnięcej odwłóknionej antybiotykami (wankomycyna, trimetoprym, amfoterycyna B i cefsulodyna) w celu ograniczenia wzrostu innych rodzajów bakterii, które mogą być obecne.

Ta sama zasada uzupełniona krwią ludzką lub jagnięcą, kwasem nalidyksowym i kolistyną jest przydatna do izolowania Gardnerella vaginalis. Jest również idealny do oceny wrażliwości na antybiotyki tego samego mikroorganizmu.

Ponadto służy do przygotowania agaru z krwią do hodowli beztlenowców, z dodatkiem aminoglikozydów i wankomycyny.

Baza ta pozwala na prawidłową obserwację wzorców hemolizy.

Agar Brucella

Podłoże używane jako baza pod agar z krwią wraz z dodatkiem witaminy K jest idealne do hodowli bakterii beztlenowych. W takim przypadku zaleca się użycie krwi baraniej.

Agar Campylobacter

Agar Campylobacter z dodatkiem 5% krwi baraniej i 5 antybiotyków (cefalotyna, amfoterycyna B, trimetoprym, polimyksyna B i wankomycyna) to podłoże stosowane do izolacji Campylobacter jejuni w próbkach kału.

Przygotowanie

Każda firma handlowa przynosi instrukcje przygotowania litra pożywki z tyłu pojemnika. W zależności od wybranego agaru bazowego można wykonać odpowiednie obliczenia, aby przygotować żądaną ilość.

Zważyć i rozpuścić

Bazowy agar jest odwodniony (proszek), dlatego należy go rozpuścić w wodzie destylowanej o pH 7,3.

Ilość wskazaną przez wybrany podstawowy agar waży się i rozpuszcza w odpowiedniej ilości wody w kolbie, następnie ogrzewa na umiarkowanym ogniu i miesza ruchem obrotowym, aż cały proszek się rozpuści.

Sterylizować

Po rozpuszczeniu sterylizować w autoklawie w 121 ° C przez 20 minut.

Agregat krwi

Wychodząc z autoklawu, kolbę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury w zakresie od 40 do 50 ° C; Jest to temperatura, którą utrzymuje ludzka skóra, a jednocześnie agar jeszcze się nie zestalił.

Aby to zrobić, należy dotknąć kolby ręką i jeśli ciepło jest do zniesienia, w idealnej temperaturze należy dodać odpowiednią ilość odwłóknionej krwi (50 ml na każdy litr agaru). Delikatnie wymieszać do homogenizacji.

Przejście agregacji krwi ma kluczowe znaczenie, ponieważ jeśli zostanie wykonane, gdy podłoże jest bardzo gorące, krwinki czerwone ulegną rozpadowi i pożywka nie będzie używana do obserwacji hemolizy.

Jeśli zostanie dodany zbyt zimno, zbryli się, a powierzchnia podłoża nie będzie gładka, aby umożliwić prawidłowe rysowanie.

Wlać do szalek Petriego

Podawać na sterylnych szalkach Petriego natychmiast po homogenizacji krwi. Około 20 ml wlewa się do każdej szalki Petriego. Ta procedura jest wykonywana w okapie z przepływem laminarnym lub w pobliżu palnika.

Podczas podawania agaru z krwią na szalkach Petriego na powierzchni płytki nie powinny pozostać pęcherzyki powietrza. Jeśli tak się stanie, płomień palnika Bunsena zostanie szybko przepuszczony przez płytę, aby je wyeliminować.

Płytki pozostawia się do zestalenia i przechowuje w lodówce (2-8 ° C) odwrócone do momentu użycia. Przed użyciem płytek agarowych z krwią należy je zahartować (pozwolić na osiągnięcie temperatury pokojowej), aby można było je wysiać.

Przygotowane płytki wystarczają na około 1 tydzień.

Bibliografia

1. Bayona M. Mikrobiologiczne warunki hodowli Helicobacter pylori. Rev Col Gastroenterol 2013; 28 (2): 94–99
2. García P, Paredes F, Fernández del Barrio M. (1994). Praktyczna mikrobiologia kliniczna. University of Cadiz, 2. edycja. Serwis Publikacji UCA.
3. „Krwawy agar”. Wikipedia, wolna encyklopedia. 10 grudnia 2018, 14:55 UTC. 27 grudnia 2018, 01:49 en.wikipedia.org.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Argentyna. Od redakcji Panamericana SA
5. CEDIVET Laboratory Veterinary Diagnostic Center. Gwatemala. Dostępne na: trensa.com.
6. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. (Wyd. 5). Argentyna, od redakcji Panamericana SA