Agar TCBS jest sposobem bardzo selektywnym, a różnicowy hodowli stałej, której użyto do izolacji i hodowli bakterii z rodzaju Vibrio, zwłaszcza Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus i V. vulnificus jako głównych patogenów tego rodzaju.
Akronim TCBS oznacza Thiosulfate Citrate Bile Sucrose. Ten agar jest również znany jako selektywne podłoże dla Vibrios. Oryginalna formuła została stworzona przez Nakanishi, a później zmodyfikowana przez Kobayashi.
Handlowe podłoże TCBS i płytka agarowa TCBS zaszczepiona Vibrio cholerae. Źródło: zdjęcie 1: wykonał mgr inż. Marielsa Gil / Zdjęcie 2: Microrao, JJMMC, Davangere, Karnataka, Indie
Zawiera ekstrakt drożdżowy, pepton mięsny, tripteinę, cytrynian sodu, tiosiarczan sodu, żółć wołową, sacharozę, chlorek sodu, cytrynian żelazowy, błękit bromotymolowy, błękit tymolowy i agar.
Taka kompozycja umożliwia odpowiedni rozwój gatunków Vibrio z próbek wody, pokarmu i kału; z wyjątkiem Vibrio hollisae, który nie rośnie na tym podłożu. Ponadto pożywka TCBS jest zdolna do hamowania wzrostu innych towarzyszących bakterii, zwłaszcza bakterii z grupy coli.
Ze względu na poważne problemy żołądkowo-jelitowe i pozajelitowe wywoływane przez niektóre gatunki z rodzaju Vibrio, bardzo ważna jest jego diagnoza. Ludzie zarażają się głównie przez spożywanie surowej lub niedogotowanej żywności z morza lub zanieczyszczonych wód, ale także przez zakażenie ran.
Z tego powodu laboratoria kliniczne muszą włączyć agar TCBS do badań hodowli kału płynnych próbek kału, zwłaszcza w przypadku pojawienia się wody ryżowej. Zwłaszcza jeśli pacjent zgłosił, że miał kontakt z wodą morską lub jadł skorupiaki lub ryby.
Podstawa
Ekstrakt drożdżowy, peptony mięsne i tripteina są źródłem składników odżywczych tego podłoża. Jednak agar TCBS jest niegościnnym podłożem dla większości bakterii.
Jego wysoką selektywność zapewnia dodatek cytrynianu sodu i żółci wołowej; oba są środkami hamującymi, które również zapewniają alkaliczne pH pożywce, ograniczając wzrost towarzyszącej flory i sprzyjając wzrostowi, między innymi, V. cholerae. Należy zauważyć, że Vibrio cholerae jest bardzo wrażliwy na kwasowość.
Ze swojej strony chlorek sodu równoważy osmotycznie medium. Ponadto, ze względu na wysokie stężenie, działa również hamująco, sprzyjając rozwojowi bakterii halofilnych.
Sacharoza jest cukrem podlegającym fermentacji, który wraz ze wskaźnikami pH błękitu bromotymolowego i błękitu tymolowego nadaje pożywce zróżnicowany charakter. Z tego powodu na tym podłożu można odróżnić szczepy fermentujące sacharozę od szczepów niefermentujących.
Kolonie szczepów fermentujących sacharozę przybierają żółty kolor i zmienią pożywkę z zielonego na żółty z powodu wytwarzania kwasu. Substancje niefermentujące stają się przezroczyste, a pożywka zachowuje oryginalny kolor (zielony).
Podobnie, to podłoże zawiera tiosiarczan sodu jako źródło siarki i cytrynian żelazowy jako czynnik wywołujący. Oba wykazują bakterie zdolne do wytwarzania siarkowodoru (bezbarwnego gazu). H 2 S jest utworzona z tiosiarczanem, a następnie po reakcji z cytrynianem żelazowym widocznym czarny osad.
Wreszcie agar zapewnia stałą konsystencję pożywce.
Przygotowanie
Odważyć 89 g odwodnionej pożywki i rozpuścić w jednym litrze wody destylowanej. Pomóż w rozpuszczaniu przez ogrzewanie i częste mieszanie. Mieszankę można gotować do 2 minut.
To podłoże nie jest autoklawowane. Po rozpuszczeniu podaje się bezpośrednio na sterylnych talerzach. Gdy zestalą się, układa się je w odwróconej kolejności na płytkach krwi i przechowuje w lodówce (2-8 ° C) do czasu użycia.
Po przygotowaniu pożywka musi mieć pH 8,6 ± 0,2.
Odwodnione podłoże ma kolor jasnobeżowy lub zielonkawo-beżowy, a kolor pożywki - leśny lub niebieskawo zielony.
Ważne jest, aby płytki rozgrzały się przed wysianiem próbek.
Posługiwać się
Najczęstszym materiałem do izolacji Vibrios jest stolec biegunkowy.
Próbki kału, jeśli nie mogą być natychmiast wysiane na pożywkę selekcyjną, należy transportować na pożywce Cary Blair.
Aby zwiększyć czułość hodowli, odchody można przepuszczać przez wodę peptonową o pH 8,4 jako pożywkę wzbogacającą przez maksymalnie 8 godzin, a następnie przechodzić do pożywki TCBS.
Należy również wziąć pod uwagę, że niektóre szczepy Vibrios mogą powodować posocznicę u pacjentów z immunosupresją, dlatego można je izolować z posiewów krwi. Podobnie, próbki wody i żywności z morza mogą być analizowane w przypadku wybuchu choroby cholery.
Posiany
Inokulum badanej próbki musi być widoczne, wysiew przeprowadza się metodą prążkowania przez wyczerpanie. Płytki inkubuje się w 37 ° C przez 24 godziny w aerobiozie.
Przypuszczalne kolonie Vibrio cholerae są średniej wielkości, gładkie, nieprzezroczyste, z cienkimi brzegami i mają żółty kolor z powodu fermentacji sacharozy.
Gatunki V. alginolyticus, V. fluvialis, V. hareyi, V. cincinnatiensis, V. furnissii, V. metschnikovii i niektóre V. vulnificus rosną w podobny sposób. Inne klinicznie ważne gatunki Vibrios, takie jak V. parahaemolyticus, nie fermentują sacharozy, rozwijając się jako kolonie oliwkowo-zielone.
Płytka agarowa TCBS wysiana Vibrio parahaemolyticus. Źródło: isis325 Flickr
Z drugiej strony należy pamiętać, że niektóre szczepy Aeromonas i Plesiomonas, które są oksydazą (+), mogą rosnąć w tym podłożu, tworząc żółte kolonie, które mogą zmylić lekarza. Podczas gdy niektóre szczepy Pseudomonas również rosną w postaci oksydazy (+) w postaci zielonych kolonii, takich jak V. parahaemolyticus.
Ograniczenie
Test oksydazy, który jest pozytywny dla rodzaju Vibrio, nigdy nie powinien być przeprowadzany z kolonii uzyskanych z agaru TCBS, ponieważ uzyskany wynik będzie fałszywie negatywny. Związki w środku silnie zakłócają ten test. Dlatego musi być zrobiony z subkultur na agarze z krwią.
QA
Aby udowodnić, że pożywka jest w dobrym stanie, zaleca się wysiać znane lub certyfikowane szczepy kontrolne i obserwować, czy wzrost spełnia oczekiwane cechy.
W tym celu możesz użyć szczepów:
-Vibrio cholerae-– wzrost zadowalający (żółte kolonie, przezroczysta obwódka).
-Vibrio parahaemolyticus --– wzrost zadowalający (kolonia z zielonym środkiem i półprzezroczystą obwódką).
-Vibrio alginolyticus ATCC 17749 - wzrost zadowalający (żółte kolonie z otoczkami tego samego koloru wokół kolonii).
-Enterococcus faecalis ATCC 29212 - całkowite lub częściowe zahamowanie (małe żółte lub przezroczyste kolonie).
-Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853-– częściowe lub całkowite zahamowanie (kolonie niebieskie).
-Escherichia coli ATCC 25922 - całkowicie zahamowany.
-Proteus mirabilis ATCC 43071 -– Całkowite lub częściowe hamowanie. (Małe kolonie zielone środkowe półprzezroczyste obramowanie).
Inkubacja niezaszczepionej pożywki powinna pozostać niezmieniona.
Bibliografia
- Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories. Agar TCBS. 2009. Dostępne pod adresem: f-soria.es
- Laboratorium BD. BD. TCBS Agar 2003, dostępny pod adresem: bd.com
- Britannia Laboratories. TCBS Medium. 2015 Dostępne pod adresem: britanialab.com
- Acumedia Laboratories. TCBS Agar. 2016 Dostępne pod adresem: foodsafety.neogen.com
- Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.
- Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnoza mikrobiologiczna. 5th ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.