AGAR THAYER MARTIN: PODKŁAD, PRZYGOTOWANIE I ZASTOSOWANIA - BIOLOGIA - 2026

Agar Thayer Martin jest wysoko odżywczą i stałe podłoże do selektywnej izolacji Neisseria meningitidis i Neisseria gonorrhoeae; obie znane jako chorobotwórcze lub klinicznie ważne Neisseria.

Jedną z najważniejszych cech charakterystycznych Thayer Martin Agar jest wysoka zawartość suplementów diety. Ta właściwość jest niezbędna, ponieważ Neisseria są mikroorganizmami bardzo wymagającymi z żywieniowego punktu widzenia i dlatego nie rosną w zwykłych pożywkach.

Thayer Martin / Agar Thayer Martin medium biznesowe. Zdjęcie źródłowe 1: Wykonane przez autora mgr inż. Marielsa Gil, zdjęcie 2. Pixinio.com bakteriakolonizowany, modyfikowany, Thayer, Martin, agar.

Z drugiej strony, ponieważ mikroorganizmy te normalnie występują w obszarach niesterylnych, dodatek inhibitorów jest konieczny, aby zapobiec wzrostowi towarzyszącej flory, bez wpływu na rozwój rodzaju Neisseria.

Agar ten składa się z agaru podstawowego GC, hemoglobiny, dodatkowych suplementów diety oraz kompleksu substancji hamujących (antybiotyki i leki przeciwgrzybicze). Domy komercyjne sprzedają każdy z dodatków osobno.

Próbka, która ma być wysiana na tym podłożu, będzie zależała od poszukiwanego mikroorganizmu. W przypadku Neisseria gonorrhoeae idealnymi próbkami są wydzieliny z pochwy i cewki moczowej. Natomiast w przypadku Neisseria meningitidis najczęściej używanymi próbkami są płyny mózgowo-rdzeniowe, wysięk z gardła i nosogardzieli.

Podstawa

Neisserias to mikroorganizmy klasyfikowane jako uciążliwe i dlatego ich izolacja jest trudna. Dlatego Thayer Martín jest złożonym medium, a każdy z jego składników spełnia funkcję, którą wyjaśniono poniżej:

Agar bazowy GC

Agar GC zawiera pepton proteozowy, skrobię kukurydzianą, chlorek sodu, fosforan dipotasowy, fosforan monopotasowy i agar-agar. Jego składniki dostarczają podstawowych składników odżywczych dla rozwoju mikroorganizmów, neutralizują toksyczne kwasy tłuszczowe, pomagają utrzymać równowagę osmotyczną, określają pH i zapewniają stałą konsystencję pożywce.

Hemoglobina

Hemoglobina dostarcza czynniki V i X (odpowiednio dinukleotyd nikotynamidoadeninowy NAD i hemina). Z tego powodu gatunki Haemophilus również rosną w tym podłożu. Hemoglobinę można uzyskać w handlu w postaci odwodnionej lub do pożywki można dodać świeżą odwłóknioną krew bydlęcą.

Dodatek wzbogacający

Z drugiej strony do pożywki Thayer-Martin należy dodać także dodatek wzbogacający, ponieważ składniki odżywcze zawarte w podstawowym agarze nie są wystarczające dla potrzeb rodzaju Neisseria.

Najpopularniejszym suplementem wzbogacającym jest isovitalex. Zawiera glutaminę, adeninę, NAD, kokarboksylazę, guaninę, azotan żelaza, kwas p-aminobenzoesowy, witaminę B12, tiaminę i glukozę. Wszystkie te związki są niezbędne do prawidłowego rozwoju patogennych Neisseria.

Inhibitory

Ponieważ jest to pożywka o wysokiej wartości odżywczej, należy stosować inhibitory, które zapobiegają rozwojowi mikroorganizmów ze zwykłej flory obszaru, a tym samym sprzyjają izolacji rodzaju Neisseria.

Kompleks inhibitorów składa się z wankomycyny, kolistyny ​​i nystatyny. Wankomycyna hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich, kolistyna zapobiega rozwojowi bakterii Gram-ujemnych, takich jak Pseudomonas i niektóre saprofityczne Neisserias, a nystatyna działa na drożdżaki, takie jak Candida albicans.

Jednak agar Thayer Martin został później zmodyfikowany; zmiany polegały na dodaniu trimetoprimu, zwiększeniu ilości agaru i dodaniu dodatkowej glukozy. Zmiany te znacznie poprawiły regenerację gatunków Neisseria gonorrhoeae.

Należy zauważyć, że trimetoprim hamuje wzrost rodzaju Proteus i wynikające z niego rojenie. W tym sensie to antybiotyki zapewniają selektywny charakter pożywce Thayer Martin.

Przygotowanie

Oryginalny agar Thayer Martin

-GC agar

Odważyć 8,2 g odwodnionej pożywki GC i zawiesić w 100 ml. Mieszaj i gotuj przez 1 minutę, często mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizuj mieszaninę w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut.

- 2% hemoglobiny

Zawiesić 2 g odwodnionej hemoglobiny w 2 lub 3 ml gorącej wody destylowanej do uzyskania jednorodnej mieszaniny. Dodawaj stopniowo więcej wody, aby uzupełnić objętość do 100 ml. Zawiesina musi być jednorodna przed sterylizacją.

Sterylizuj w autoklawie przez 15 minut.

- dodatek wzbogacający

Rekonstytuować handlową fiolkę rozcieńczalnikiem dostarczonym przez tę samą firmę handlową. Dobrze wymieszać. Ilość używanego rozcieńczalnika zostanie podana w instrukcji zestawu.

- suplement hamujący VCN (wankomycyna, kolistyna, nystatyna)

Zrekonstytuować fiolkę rozcieńczalnikiem dostarczonym przez firmę handlową. Dobrze wymieszać. Ilość używanego rozcieńczalnika zostanie podana w instrukcji zestawu.

-Przygotowany

Na każde 100 ml agaru GC należy postępować w następujący sposób:

Gdy agar GC opuści autoklaw, pozostaw go do ostygnięcia do temperatury około 50 ° C i dodaj 2 ml przygotowanego roztworu hemoglobiny, 2 ml suplementu wzbogacającego (isobitalex lub britalex) i 2 ml suplementu hamującego. Wymieszaj i podawaj na sterylnych szalkach Petriego.

Pozostaw do zestalenia i przechowuj w lodówce do momentu użycia.

Kolor przygotowanego podłoża to wiśniowy. Końcowe pH pożywki wynosi 7,2 ± 0,2

Zmodyfikowany agar Thayer Martin

Odważyć 8,2 g odwodnionej pożywki GC i zawiesić w 100 ml. Dodaj 1 g agaru i 0,3 g glukozy. Mieszaj i gotuj przez 1 minutę, często mieszając, aż do całkowitego rozpuszczenia. Sterylizuj mieszaninę w autoklawie w 121 ° C przez 15 minut.

Przygotuj hemoglobinę i suplement wzbogacający, jak opisano wcześniej.

Stosowanym suplementem supresyjnym jest VCNT (wankomycyna, kolistyna, nystatyna, trimetoprim).

-Przygotowany

Postępuj zgodnie z opisem dla oryginalnego agaru Thayer Martin.

Posługiwać się

Thayer Martin Agar należy pozostawić do ogrzania, zanim okazy zostaną posiane. Powszechnie stosowanymi próbkami są wymazy z gardła, wymazy z nosa, wydzielina z pochwy, cewki moczowej i / lub odbytu oraz płyn mózgowo-rdzeniowy.

Użyj świeżych próbek i zrób mocne inokulum na agarze. Próbki wysiewa się bezpośrednio przez wyładowanie materiału, a następnie wysycha na powierzchnię.

Płytki inkubuje się w temperaturze 35-37 ° C przez 24 do 48 godzin w słoiku mikroaerofilnym (5% CO ₂ ). Pod koniec okresu inkubacji płytki bada się pod kątem małych, szarych i czasami śluzowatych kolonii.

Wykonaj Gram i potwierdzające testy biochemiczne na podejrzanych koloniach.

QA

Do kontroli jakości Thayer Martin Agar można zastosować następujące szczepy drobnoustrojów.

Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226 i Neisseria meningitidis ATCC 13090; oczekiwany jest zadowalający rozwój obu szczepów.

Należy również uwzględnić następujące szczepy: Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus mirabilis ATCC 43071 i Candida albicans ATCC 10231. We wszystkich z nich oczekuje się całkowitej lub częściowej inhibicji w tym podłożu.

Ograniczenia

-Należy pamiętać, że w podłożu mogą rosnąć bakterie odporne na zastosowane inhibitory.

-Istnieją szczepy Neisseria gonorrhoeae, które mogą być wrażliwe na stężenie zastosowanej wankomycyny. Z tego powodu zaleca się stosowanie agaru czekoladowego z dodatkiem izowitalexu, ale bez inhibitorów.

-Istnieją szczepy drożdży opornych na nystatynę, które mogą rosnąć w tym podłożu i przeszkadzać w izolacji patogennych Neisserias, zwłaszcza gonokoków.

Bibliografia

1. Laboratoria diagnostyczne Valtek. Agar Thayer-Martin.2016. Dostępne pod adresem: com
2. Britannia Laboratories. Thayer Martin Medium zmodyfikowano. 2010 Dostępne pod adresem: britanialab.com
3. Współtwórcy Wikipedii. Agar Thayer-Martin. Wikipedia, wolna encyklopedia. 26 października 2017, 16:33 UTC. Dostępne pod adresem: wikipedia.org 4. Dostęp 28 lutego 2019 r.
4. Britannia Laboratories. Agar GC. 2010 Dostępne pod adresem: britanialab.com.
5. Laboratoria BBL ™ Medium Enrichment dla wybrednych mikroorganizmów. 1999. Dostępne w: bd.com
6. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Diagnoza mikrobiologiczna Bailey & Scott. 12 ed. Od redakcji Panamericana SA Argentina.